Extracciòn de DNA a partir de células del epitelio bucal

1. Extracción del ADN
Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern
Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa)

2. Relevancia
del
Aislamiento
del ADN
La extracción de ADN es el primer
paso en la tecnología del ADN.
• Determinación del perfil de ADN
• Clonación
• Diagnóstico de enfermedades
• Determinación de secuencias de ADN
• Transferencia génica: Organismos Modificados
Genéticamente (OMG), agricultura,
farmacéutica
• Pruebas ambientales, bioterrorismo

3. ¿Cuáles son las estructuras de una célula?

4. Tipos de
Células

5. Tipos de
Células

6. Tipos de
Células

7. Resumen
del
Protocolo:
Extracción
de ADN
Genómico
• Utilización de agua como enjuague para la
recogida de las células bucales
• Añadir el búfer de lisis para romper las
membranas nucleares y celulares y liberar el
contenido nuclear
• Utilización de la proteasa para digerir las
proteínas celulares
• Precipitación del ADN con alcohol frío y alta
concentración de sal.

8. Extracción
de ADN :
Paso-a-
Paso

9. Puesto común (Puesto del Maestro)
Baño a 500
C
Botella de isopropanol 91% o etanol 95%, en hielo
Puesto de trabajo de los alumnos
Número
(4 Estudiantes/Puesto de trabajo )
Tubos de15 ml con 3 ml de agua 4
Microtubo rosa marcado “prot”,
con 1.25 ml de proteasa rehidratada con sal 1
Tubo de 15 ml tubo marcado “lisis” con 10 ml de búfer de 1
Pipetas de plástico 6
Gradilla de hule espuma para los tubos 1
Marcador de tinta indeleble 1
Taza de papel dispensable o un beaker para sostener los 1
tubos de 15 ml y la subsiguiente colección de basura
Materiales para hacer el collar de ADN o un micortubo de1.5ml 1
Guía rápida 1
Extracción y
Precipitación
de ADN
Listado de
Materiales
4 Estudiantes/Puesto de
trabajo para un total de
36 Estudiantes

10. Es de vital
importancia
realizar una
abundante
recogida de
células.
Para mejores resultados, asegúrese que
los alumnos empleen la suficiente
cantidad de tiempo recogiendo las
células de la mucosa bucal.
Pueda que la colección de muestra en el
tubo de 15 mL sea difícil. Puede utilizar
un vaso pequeño para dispensar y
coleccionar la muestra.

11. Protocolo de
Práctica de
Laboratorio
1. Obtenga del instructor un tubo de 15 mL que
contenga 3 ml de agua. Marque el tubo con sus
iniciales.
2. Cuidadosamente mordisquee el interior de los
cachetes por 30 segundos. ¡No sirve de nada
sacar sangre!
3. Tome el agua del tubo de15 mL, y con el agua
enjuague por 30 segundos.
4. Cuidadosamente escupa el liquido de regreso al
tubo de 15 mL.
Pasos 1 − 4

12. Protocolo de
Práctica de
Laboratorio
5. Obtenga el tubo de búfer de lisis del puesto de
trabajo y añade 2 mL de búfer de lisis a su tubo
que contiene el extracto celular.
6. Cierre el tubo e inviértalo suavemente para
mezclar los componentes. (¡No lo mezcle muy
duro!). Observe su tubo — ¿Ve algunos
cambios? Anótelos.
Pasos 5 − 6

13. Protocolo de
Práctica de
Laboratorio
7. Obtenga el tubo de proteasa
(marcado “prot”) de su puesto
de trabajo. Añade 5 gotas de
proteasa a su tubo.
8. Cierre el tubo y voltéelo
suavemente varias veces.
9. Coloque su tubo en la gradilla o
en un beaker en el baño de
agua y déjelo incubar por 10
minutos a 50°C.
Pasos 7 − 9

14. Extracción y
precipitación
de ADN
¿Por qué se lleva a cabo
cada paso?

15. 1. Colección
de células
El mordisqueo del
interior de la boca, en
combinación con el
enjuague de agua
funciona para separar
las células del epitelio
alineando la boca.
Es crítico recoger la
cantidad suficiente de
células.

16. 2. Búfer de
Lisis
¿Qué es el Búfer de
Lisis?
• 50 mM Tris-HCI, pH 8.0
• 1% SDS
Búfer deTris para
mantener el pH de la
solución en el cual ADN se
mantiene estable
1% SDS para romper y
abrir las membranas
celulares y nucleares
permitiendo que el ADN
quede libre en la solución.
El detergente SDS
desnaturaliza y desdobla
las proteínas dejándolas
accesibles para las
proteasas.
O
S
O
O
O
-
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH3
SDS
Na+

17. 3. ¿Por qué
utilizamos la
proteasa?
• La proteasa se utiliza para destruir las
proteínas nucleares que crean un enlace
con el ADN y para destruir enzimas
citoplasmáticas que degradan y
destruyen el ADN.
• El tratamiento con proteasa incrementa
la cantidad de ADN intacto que es
extraído.

18. 4. Adición de
la solución
salina • La solución de proteasa ya contiene sal.
• Los iones de Na+
del NaCI forman enlaces
con los grupos de fosfato de las
moléculas de ADN, neutralizando las
cargas eléctricas del ADN.
• La adición de NaCI permite que las
moléculas de ADN se junten en lugar de
repelerse una a la otra. De esta manera
se facilita la precipitación del ADN de la
solución al añadir el alcohol.

19. Na+
Na+
Na+
Na+
OCH2
O
P O
O
O Base
CH2
O
P
O
O
O
Base
OH
Azúcar
Azúcar
O
La
Estructura
del ADN
Sólo se
muestra una
cadena de
ADN.

20. 5. Precipitación
del ADN con
alcohol frío
• El ADN no se disuelve en alcohol.
• El añadir alcohol hace que el ADN se agregue y
se precipite de la solución.
• Las moléculas del ADN precipitadas parecen un
material fibroso, como los hilos blancos de una
telaraña.
• Las burbujas microscópicas de oxígeno, que se
generan al mezclar, se “agregan” al precipitarse
el ADN.
• Las burbujas visibles más grandes, levantan el
ADN fuera de la solución y lo llevan de la fase
acuosa a la fase orgánica (fase del alcohol).

21. Protocolo de
Práctica de
Laboratorio
10. Lentamente añade 10 ml de alcohol frió
manteniendo el tubo a un ángulo de 45°. Este paso
va a requerir de varias adiciones utilizando la
pipeta de transferencia desechable.
11. Deje el tubo en posición vertical en la gradilla, a
temperatura ambiente y en reposo, durante 5
minutos ¿Que ve?
12. Cierre el tubo y voltéelo de lado y de regreso en
posición vertical, con mucho cuidado, unas 10
veces, hasta que las fases de agua y alcohol
queden mezcladas y el ADN salga de solución.
Pasos 10 − 12

22. Preparación
de los
tapones para
los collares
1. Remueva el tapón de plástico del frasco de
vidrio.
2. Recorte las “orejas” de dos lados del tapón de
plástico.
3. Regréselo al frasco para crear los collares más
tarde.
¿Porque?
Para que el tapón no cree una bolsa de aire
que prevenga que el frasco quede
correctamente cerrado

23. Preservando
la muestra
de ADN:
Preparación
del collar de
ADN
1. Utilizando una pipeta desechable, transfiera
las fibras de ADN que ha extraído al pequeño
frasco de vidrio.
– Transfiera la mayor cantidad de ADN con
la menor cantidad de alcohol posible.
– El frasco se debe rellenar dejando por lo
menos 2 mm de espacio suficiente para el
tapón de plástico.

24. Preservando
la muestra
de ADN:
Preparación
del collar de
ADN
2. Introduzca el tapón de plástico recortado en el
cuello del frasco y presione con firmeza para
cerrarlo
3. Deslice el cordón encerado a través del tapón de
plata
4. Aplique una pequeña gota de pegamento en el
interior del tapón de plata.

25. Preservando
la muestra
de ADN:
Preparación
del collar de
ADN
5. Coloque el tapón de plata sobre la boca
del frasquito y presione con firmeza
durante 30 segundos. Deje que el
pegamento se seque durante 10-15
minutos y después compruebe que el
frasquito está completamente sellado.
6. Cuando el pegamento se haya secado, ate
el cordón encerado.

26. Genes en
un Frasco
¡Felicidades!
¡Has creado un collar con tu propio
ADN!

27. ¿Cuánto
tiempo
dura el
collar de
ADN?
El ADN puede durar
años en el frasquito
de vidrio. Con el
tiempo puede añadir
más alcohol si la
cantidad original se
ha evaporado

28. Genes en un
Frasco
Componentes
del kit
DNA Extraction
Module (166-2000EDU):
(contains enough material for 36 students)
Lysis buffer, 150 ml
Powdered protease + salt, 1.5 g
15 ml tubes, 50
Clear, flip-top microtubes, 60
Multicolor, flip-top microtubes, 60
Disposable plastic transfer pipets, 60
Foam microtube holders, 10
Curriculum, including a teacher’s
guide, a graphic quick guide, and
separate student instructions for
basic and advanced-level instruction
DNA Necklace
Module (166-2200EDU):
(contains enough material for 18 DNA
necklaces; order 2 modules for a
classroom of 36 students)
Glass vials, 18
Silver caps, 18
Plastic plugs, 18
Waxed string, 18
Super glue gel, 1 tube
Instruction manual
Required Accessories Not
Included in Kit:
91% isopropanol (available from
drugstores) or 95% ethanol, 360 ml
Container of ice, 1
Permanent marker, 1–8
Recommended (Optional)
Accessories:
Water bath with thermometer
166-0504EDU
(166-2300EDU)
Materiales para 36
Estudiantes
Above Kit Contains:
(1) DNA Extraction
Module (166-2000EDU)
(2) DNA Necklace
Modules (166-2200EDU)