Studi di associazione genetica e disegno sperimantale caso- controllo

Studi di associazione genetica e
disegno sperimantale caso-
controllo
Applicazioni allo studio del Diabete di Tipo1 e della
Sclerosi Multipla nella popolazione sarda

Ilenia Zara
ilenia.zara@crs4.it
Aula Magna Dipartimento di Fisica
Cittadella Universitaria di Monserrato
30 Marzo 2011

Wednesday, March 30, 2011

BIOMEDICINA ENERGIA
E AMBIENTE
DATA FUSION Collana di Seminari per la Valorizzazione dei Risultati della Ricerca al CRS4

30.03.2011
Seminario 16:00 -18:00 P.M.
AULA MAGNA DIP. FISICA
Cittadella Universitaria - Monserrato
I recenti sviluppi delle nuove piattaforme sperimentali
consentono di studiare le caratteristiche genetiche di intere
popolazioni utilizzando volumi di dati sempre crescenti con
costi sempre minori. Questo tipo di studi rende necessaria
l’interazione tra persone con una formazione medico/
biologica e persone con competenze nei campi della statistica
Studi di associazione genetica e e dell’informatica.
disegno sperimentale “caso controllo”:
applicazioni a diabete di tipo 1 e sclerosi multipla nella popolazione Sarda
Durante il seminario saranno illustrati i concetti genetico-
statistici che stanno alla base degli studi GWAS e i risultati di
ricerca ottenuti con tale approccio per identi care varianti
genetiche predisponenti al diabete di tipo 1, alla sclerosi
multipla e alle malattie autoimmuni in generale, nella
popolazione Sarda.
Relatore: Ileniasviluppi delle nuove piattaforme sperimentali consentono
Relatore I recenti Zara
Ilenia Zara di studiare le caratteristiche genetiche di intere popolazioni utlizzando
CRS4 volumi di dati sempre crescenti con costi sempre minori.
Questo tipo di studi rende necessaria l’interazione tra persone con una
formazione medico/biologica e persone con competenze nei campi
della statistica e dell’informatica.

Indice degli argomenti

• Background
• Studi di associazione
• Perchè questo studio sulla popolazione sarda?
• Workﬂow dello studio
• Risultati ottenuti
• Lavori in corso


Variabilità genetica
• Le variazioni genetiche
spiegano la maggior
parte della variabilità
osservata tra individui
della stessa specie
• Il crossing-over è un
meccanismo di
ricombinazione del
materiale genetico
proveniente dai due
genitori.


Studi di associazione
• Studio caso-controllo

An epidemiological study design in which cases with a
deﬁned condition and controls without this condition are
sampled from the same population. Risk-factor
information is compared between two groups to
investigate the potential role of these in the etiology of the
condition.
Krina T. Zondervan and Lon R. Cardon “The complex interplay among factors that
inﬂuence allelic association” - Nature Genetics Reviews - 2004


• Studio caso-controllo:

Variante genetica

Controlli: individui non aﬀetti Casi: individui aﬀetti


• Studio caso-controllo: caso ideale
• Malattie monogeniche, penetranza completa
Variante genetica causale

Variante genetica protettiva



• Studio caso-controllo: malattie multifattoriali

Variante genetica causale




• Studio caso-controllo: malattie multifattoriali
• p-value: probabilità che la variante considerata NON sia associata alla malattia

Variante genetica causativa



No Associazione 1 > p-value > 0 Associazione

Studio caso-controllo

• Obiettivo: identiﬁcare varianti genetiche con frequenze
diverse in casi e controlli, che possano rappresentare un
fattore di rischio o protettivo verso l’insorgenza di una
patologia.

• Assunzione: casi e controlli provengono da una
popolazione omogenea e possono essere utilizzati per
stimare le distribuzioni dei marcatori genetici nella
popolazione sottostante.


• Studio di associazione per tratti quantitativi
• Correlazione tra variabilità genetica e fenotipica


• Studio di associazione per tratti quantitativi
• Es. altezza


Tipi di studi
• Genome-wide
– Studio in cui si cerca di identiﬁcare le varianti causali lungo
tutto il genoma
• Candidate marker
– Studio di un marcatore che si ritiene essere implicato nel
meccanismo di insorgenza di una patologia
• Candidate gene
– Studio dei marcatori che cadono nella regione di un gene
• Fine mapping
– Studio ad alta risoluzione di marcatori che cadono in un’intera
che può contenere uno o più geni


Marcatori genetici
un marcatore genetico è costituito da una diﬀerenza nel
DNA tra due o più individui
• Marcatori multiallelici o multiforme
– microsatelliti, inserzioni, delezioni
– Copy Number Variations, Copy Number
Polymorphism
– Riarrangiamenti su larga scala (duplicazioni,
traslocazioni, inversioni, etc.)

• SNPs (Polimorﬁsmi a Singolo Nucleotide)


Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

• Marcatore biallelico
• Variazione di un singolo
nucleotide in un altro
• Il polimorﬁsmo è
considerato stabile se
osservato in almeno l’1%
della popolazione
• ∼2001: prime applicazioni
in laboratorio


Single Nucleotide Polimorphism (SNP)

• Si stima che ci siano circa
30,000,000 SNPs nel
genoma umano
• Nascono come mutazioni
(MAF<1%)
• La maggior parte
scompare ma alcuni si
stabilizzano
• caso
• selezione naturale


Progressi nelle tecnologie di genotipizzazione

2001
2002
2003
2004 10 3

2005
2006
2007
2008 Next Generation
Sequencing
2009

1 10 100 1,000 10,000 100,000 1,000,000


Due case produttrici di microarrays utilizzati in studi GWAS

Aﬀymetrix Genome-Wide
Human SNP 6.0
www.aﬀymetrix.com

Illumina 1M Duo beadchip
www.illumina.com


• Che cosa c’è in una probe?

www.aﬀymetrix.com


• Concetti base
–Ibridazione
–Lettura con scanner
ad alta risoluzione
–Immagine


Quali SNPs?


Progetto HapMap
• Database pubblico dei pattern comuni di variazione
genetica nel genoma umano
• Scopo: fornire ai ricercatori una mappa aplotipica del
genoma umano


Linkage Disequilibrium
• fenomeno per cui due o più alleli non segregano in
maniera indipendente
• Gran parte del genoma cade
in segmenti di forte LD detti
blocchi di aplotipi, separati da
segmenti di basso LD
• All’interno di ciascun blocco le
varianti presenti sono tra loro
fortemente correlate e un
piccolo numero di
combinazioni di alleli distinti
(aplotipi) rappresentano la
maggior parte delle variazioni
genetiche nella popolazione
considerata

Non è necessario studiare tutti gli SNPs del genoma!

Associazione diretta Associazione indiretta
• Gli SNPs vengono testati • Gli SNPs vengono
in base alle conoscenze a genotipizzati in base al
priori sulla loro funzione Linkage Disequilibrium
• L’individuazione della
variane causale dipende
dalla sua correlazione con
la variante genotipizzata


Workﬂow

• Studi di associazione Genome-Wide
– Deﬁnizione casi e controlli
– Raccolta campioni biologici e dati clinici
– Genotipizzazione
– Controlli di qualità su individui e marcatori
– Analisi della struttura della popolazione
– Test di associazione
– Inferenza di marcatori non genotipizzati
– Annotazione dei risultati e selezione marcatori candidati
e regioni corrispondenti


Selezione casi e controlli

• Perchè la popolazione sarda?

• Perchè le malattie autoimmuni?



– Dimensione del campione adeguata al tipo di studio
• Dimensione della popolazione abbastanza elevata da consentire
di mantenere una elevata variabilità tra gli individui

– Popolazione Isolata
• Assenza sostanziale di sottostruttura di popolazione (basso tasso
di immigrazione)
• Presenza di varianti comuni nei sardi e rare o assenti in altre
popolazioni
• Nonostante sia una popolazione europea, si comporta come un
outlier rispetto alla gamma di variabilità europea



– Alta incidenza di malattie autoimmuni in Sardegna
• Es.: l’incidenza del Diabete di Tipo 1 è 5 volte maggiore che nel
resto d’Italia e pari all’incidenza osservata in Finlandia

– Altre ipotesi
• Gli stessi fattori genetici che predispongono alle malattie
autoimmuni potrebbero in passato aver protetto la popolazione
da alcune infezioni batteriche
• Protezione nei confronti di alcune forme di tumore (modelli
murini)
• Longevità (ipotesi)


Raccolta campioni biologici e dati clinici
• Raccolta iniziata circa 20 anni fa
• Gran numero di persone e
istituzioni coinvolte
• ∼2500 volontari sani provenienti
da vari centri trasfusionali e
ospedali dell’isola
• ∼2500 pazienti aﬀetti da
Sclerosi Multipla
• ∼1500 pazienti aﬀetti da
Diabete di Tipo 1
• La raccolta dei campioni
continua!


Raccolta campioni biologici e dati clinici
• Accurata deﬁnizione dei
fenotipi clinici
• Accurata selezione dei controlli
rispetto al fenotipo da testare
• Età
• Sesso
• Appartenenza eﬀettiva alla
popolazione sarda
• Altri fenotipi presenti solo nei
casi o solo nei controlli


Database dati clinici (beta)

-> Seminario Gianmauro Cuccuru - “Approccio integrato alla gestione
dati in ambito clinico e genetico” - 25 Maggio 2011

Genotipizzazione
• ∼6700 individui già
genotipizzati

• ∼840 individui

• Non imparentati
• Trios
• Famiglie
multigenerazionali con
più aﬀetti per famiglia
Esempio: plot di calling per SNP Aﬀymetrix

J. M. Korn, et al.: Integrated genotype calling and association analysis of SNPs, common copy number
polymorphisms and rare CNVs. Nat. Genet. Technical Reports, ng237 (October 2008)


LIMS (beta)

-> Seminario Gian Franco Frau - “Laboratory Information Management
System - Perchè e per cosa?” - 7 Settembre 2011

Controlli di qualità sugli individui

• Callrate >90%, 95%, 98%
– % genotipi chiamati per individuo rispetto al totale
• Corrispondenza tra sesso annotato e sesso inferito
– Sesso inferito in base all’eterozigosità del cromosoma X
• Verifica delle relazioni di parentela annotate
– Mediante test di verosimiglianza tra genotipi reali e genotipi
attesi in base alla relazione di parentela dichiarata
– Test effettuato su oltre 5000 varianti di buona qualità
altamente polimorfiche


Controlli di qualità sugli SNPs

• Callrate > 95% o > 98%
– % genotipi chiamati per un dato SNP sul totale degli
individui

• Assenza di deviazioni dall’equilibrio di Hardy-
Weinberg nei controlli

p frequenza allele 1
q frequenza allele 2



• Equilibrio di Hardy-Weinberg. Ipotesi:
– Popolazione inﬁnita
– Assenza di ﬂussi migratori
– Non selezione
– Non mutazione
• Eliminazione SNPs con HWEp<0.000001
• Un discostamento dall’equilibrio di Hardy-Weinberg
nei casi può essere indice di associazione



• Minor Allele Frequency
– Alleli con frequenza < 1% sono varianti rare
– Diminuisce il potere di identiﬁcazione delle deviazioni
dall’HWE
– Possono nascondere errori di genotipizzazione
– Possono generare associazioni spurie, perchè possono
comparire in individui con fenotipi estremi

• Eliminazione marcatori con MAF<1% o MAF<5%



• Eliminazione SNPs con eccesso di errori mendeliani

• Eliminazione SNPs con eccesso di maschi eterozigoti
sul cromosoma X

• Eliminazione SNPs con eccessivo tasso d’errore su
dupliche

Cut-oﬀ deﬁniti in base ai dati disponibili


Passi successivi

–Selezione individui non imparentati per test di
associazione
• Veriﬁca dell’assenza di parenti

–Controlli su SNPs testati comunque
• Controllo callrate nei soli casi e nei soli controlli
• Diﬀerenza tra callrate nei casi e callrate nei controlli non eccessiva
• Controllo MAF nei soli casi e nei soli controlli
• HWEp nei casi


Analisi della sottostruttura di popolazione

• Stratificazione genetica:
–fattore di confounding dovuto alla presenza di
differenze di frequenze alleliche tra casi e controlli
non correlate al fenotipo di interesse

• Può portare all’identificazione di falsi positivi


Analisi della sottostruttura di popolazione

• Principal Component Analysis (PCA)
– Software Eigenstrat (http://genepath.med.harvard.edu/
~reich/EIGENSTRAT.htm)
– Mediante analisi di matrici di covarianza riduce lo spazio dei
dati identificando gli assi di maggior variazione delle
frequenze alleliche
– Consente di identificare outliers
– Consente di effettuare un test di associazione corretto per
sottostruttura di popolazione
– Analisi effettuata su 100,000 SNPs di buona qualità,
altamente polimorfici


Test di associazione
• Errore per test multipli
• Accettare un errore del 5% e testare 600,000 SNPs signiﬁca
accettare un errore pari a
0.05 * 600,000 = 30,000 associazioni false

• Correzione di Bonferroni
• Assumendo un errore del 5% e testando 600,000 SNPs la soglia di
signiﬁcatività per il mio test è
0.05 / 600,000 = 8.3 * 10-8

• La correzione di Bonferroni assume però indipendenza tra i test e
si rivela eccessivamente conservativa in presenza di LD


Test di associazione


Possibili svantaggi

• I patterns di LD nelle popolazioni HapMap possono
non riﬂettere i patterns di LD nella popolazione
oggetto dello studio

• Anche se gli SNPs selezionati per la creazione dei
chips non sono random, ma sono stati scelti per
essere rappresentativi (tag SNPs), HapMap non è un
database esaustivo


Possibili svantaggi

• Abbiamo visto che il numero di casi e controlli
necessario per trovare un’associazione dipende
anche dal LD con la variante causale. In che modo?


Inferenza
• I metodi di inferenza sviluppati da statistici e
informatici consentono di incrementare il numero di
marcatori testati, a costi molto bassi rispetto a quelli
degli esperimenti

• Nuovi genotipi possono essere inferiti a partire da
diversi pannelli di referenza
– HapMap ∼3 milioni di SNPs
– 1000 Genomes Project ∼13 milioni di SNPs
– Sequenze di individui Sardi ∼10 milioni di SNPs


1000 Genomes Project


1000 Genomes Project
• Scopo
• fornire un catalogo completo di
• varianti genetiche umane (freq.>=1%)
• varianti con frequenza <1% nelle regioni dei geni
• dati di sequenza di alta qualità per l’85% del genoma
• 629 individui
• varie popolazioni Africa, Asia, Europa e America

• Il catalogo include SNPs, CNV, inserzioni e delezioni
• Il catalogo è fruibile gratuitamente


Pannello sequenze sarde

• 508 individui sequenziati

• 13,313,964 SNPs identiﬁcati
• ∼45% presenti in dbSNP
• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/
• ∼55% SNPs non descritti

-> Seminario Frederic Reinier - “Sequenziamento e analisi
bioinformatica del genoma umano” - 11 Maggio 2011


Inferenza di marcatori non genotipizzati


Inferenza di marcatori non genotipizzati

-> Seminario Serena Sanna “L’inferenza statistica e la lettura dei dati”


Annotazione Risultati

• Quali informazioni per ogni SNP?
• Risultati test di associazione
• Risultati controlli di qualità
• Gene in cui cade lo SNP o gene più vicino
• Posizione e distanza dello SNP rispetto al gene
• Tipologia dell SNP
• Funzione del gene, quando nota


Ispezione visiva plot di calling

• casi e controlli
• casi
• controlli


Ispezione visiva plot di calling

• casi e controlli
• casi
• controlli
SNP da scartare!


Cosa succede dopo l’associazione?

• Selezione marcatori candidati
• Replica associazione su un dataset indipendente
• Analisi aplotipiche nelle regioni selezionate
• Interpretazione biologica dei risultati
• Studi funzionali
• Studi su modelli animali


• Replica e estensione Risultati
– Genotipizzazione con un’altra tecnologia dei marcatori
selezionati negli stessi individui e calcolo del tasso di
concordanza
– Genotipizzazione con un’altra tecnologia dei marcatori
selezionati in un set di individui indipendente

http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home.html


• Analisi condizionale
– Valutazione della presenza di varianti associate indipendenti
nello stesso aplotipo
– Valutazione dell’associazione dei marcatori rispetto
all’associazione degli aplotipi di cui fanno parte
• Studi funzionali
– Studi dell’espressione dei geni in cui cadono gli SNPs
associati o dei gene vicini
– Studi dei prodotti proteici dei geni in cui cadono gli SNPs
associati o dei gene vicini
• Studi su modelli animali
– Studi funzionali su modelli animali delle patologie


Primi risultati


Primi risultati

• top SNP
• genotipizzato, non presente in HapMap II
• presente solo nel chip Aﬀymetrix
• p-value su dati genotipizzati 7.9*10^-5
• p-value dopo inferenza su HapMap III e 1000
Genomes ∼3*10^-6
• p-value su 1775 casi e 2005 controlli 9.34*10^-6


Primi risultati

• Il top SNP identiﬁcato spiega tutta
l’associazione al locus in cui si trova

• Le analisi condizionali non hanno mostrato segnali
indipendenti

• Anche l’associazione degli aplotipi è meno
signiﬁcativa di quella del marcatore singolo


Ipotesi di interpretazione biologica

• Topi con deﬁcit nell’ortologo di CBLB presentano alta
suscettibilità allo sviluppo dell’encefalomielite
autoimmune
Chiang, Y.J. et al., Nature 403, 216-20 (2000)

• Il gene potrebbe avere un ruolo più generale nelle
malattie autoimmuni è infatti un gene di suscettibilità
per diverse malattie autoimmuni, tra cui il T1D, in diversi
modelli murini
Yokoi N. et al., Nat Genet 31(4), 391-4 (2002)
Mordes J.P., et al. ILAR J 45(3), 278-91 (2004)


• Il processo inﬁammatorio nella MS è causato
dall’attività dei linfociti T, che riconoscono la mielina
come estranea e la attaccano
• Studi su modelli animali mettono in evidenza anche
un ruolo dei linfociti B nello sviluppo della malattia



• CBLB regola negativamente l’attività di TCR (T-cell
receptors) e BCR (B-cell receptors)


Ipotesi aggiuntive

• Inoltre, altri studi hanno dimostrato che topi con
deﬁcit nel CBLB non sviluppano alcuni tipi di tumore
Loser, S. & Penninger, J.M. Semin. Immunol. 19, 206-214 (2007)

• Le variazioni nel gene CBLB sembrano essere critiche
nel mantenimento del delicato equilibrio tra
l’attivazione e la tolleranza immunologica con eﬀetti
opposti nell’autoimmunità e nel cancro


Lavori in corso
• Estensione casistica (∼7000)
–GWAS Sclerosi Multipla
• 1922 controlli
• 2280 casi
–GWAS Diabete di Tipo 1
• 1917 controlli
• 1377 casi
–GWAS Autoimmunità (MS+T1D)
• 1915 controlli
• 3595 casi


Lavori in corso
• Nuove genotipizzazioni
– Aﬀymetrix 6.0
– Illumina 1M
• Nuove sequenze
– Illumina HiSeq
• Nuova imputazione
– 1000 Genomes
– Sequenze Sarde
• Studi funzionali per capire meglio il ruolo di CBLB
nella predisporre alla MS


Ringraziamenti

Serena Sanna Sandra Lai Andrea Angius
Maristella Pitzalis Antonella Mulas Maurizio Melis
Magdalena Zoledziewska Gianmauro Cuccuru Giulio Rosati
Carlo Sidore Eleonora Porcu Gonçalo R Abecasis
Raﬀaele Murru Liming Liang Manuela Uda
Michael B Whalen Patrizia Zavattari Maria Giovanna Marrosu
Fabio Busonero Loredana Moi David Schlessinger
Andrea Maschio Elisa Deriu Francesco Cucca
Gianna Costa M Francesca Urru
Maria Cristina Melis Michele Bajorek
Francesca Deidda Maria Anna Satta
Fausto Poddie Eleonora Cocco
Laura Morelli Paola Ferrigno
Gabriele Farina Stefano Sotgiu
Yun Li Maura Pugliatti
Mariano Dei Sebastiano Traccis


Ringraziamenti

Francesco Cucca Lidia Leoni Giuditta Lecca
Chris Jones Muriel Cabianca Fabrizio Murgia
Luca Carta Carole Salis
Serena Sanna Antonio Concas
Eleonora Porcu Carlo Impagliazzo Andrea Mameli
Carlo Sidore Sergio Mallus Massimo Mancini
Maria Valentini Marco Moro Loredana Lai
Michele Muggiri Fabio Bandel
Rossano Atzeni Marco Pinna
Riccardo Berutti Luca Pinna Tutti i volontari!
Frederic Reinier Franco Piroddi
Carlo Podda
Andrea Angius Matteo Vocale
Roberto Cusano
Marco Marcelli
Manuela Oppo
Rosella Pilu
Maria Francesca Urru

Riferimenti
• Sanna S. et al. A GWAS in Sardinians reveals a novel gene associated with multiple sclerosis - European
Society Of Human Genetics (ESHG) 2010
• Sanna S. et al. Variants within immunoregulatory CBLB gene are associated with multiple sclerosis Nat
Genet 42(6):495-7 (2010)
• Sanna S. Genome-wide association studies: past, present future - Seminar (2009)
• Finny Kuruvilla, Broad Institute of Harvard and MIT Massachussetts General Hospital - Genotyping on
the Aﬀymetrix platform using Birdseed (2077)
• Krina T. Zondervan and Lon R. Cardon The complex interplay among factors that inﬂuence allelic
association Nat Genet Reviews (2004)
• Lampis et al. Human Molecular Genetics. 2000, 9, 2959-2965
• Pugliatti et al. (EBC), Eur J Neurol (2006)
• J. M. Korn, et al.: Integrated genotype calling and association analysis of SNPs, common copy number
polymorphisms and rare CNVs. Nat. Genet. Technical Reports, ng237 (2008)
• Chiang, Y.J. et al., Nature 403, 216-20 (2000)
• Yokoi N. et al., Nat Genet 31(4), 391-4 (2002)
• Mordes J.P., et al. ILAR J 45(3), 278-91 (2004)
• Loser, S. & Penninger, J.M. Semin. Immunol. 19, 206-214 (2007)


Riferimenti

• http://www.aﬀymetrix.com
• http://www.illumina.com/
• http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home.html

• http://genepath.med.harvard.edu/~reich/EIGENSTRAT.htm

• http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/
• http://www.1000genomes.org/


Grazie per l’attenzione!

Ilenia Zara
ilenia.zara@crs4.it


BIOMEDICINA ENERGIA
E AMBIENTE
DATA FUSION Collana di Seminari per la Valorizzazione dei Risultati della Ricerca al CRS4

20.04.2011
prossimo appuntamento...
SALA AUDITORIUM
via Roma, 253 - Cagliari
Seminario 11:00 -12:30 A.M.
20 aprile 2011
La “rivoluzione digitale”, in atto da anni in tutti i settori della vita
quotidiana, sta investendo in modo sempre più intensivo la
Medicine goes digital

medicina in generale e la pratica clinica: la tecnologia è ormai
diventata un fattore pervasivo ed importante nell’ambito dei processi
di cura, contribuendo a migliorare l’assistenza ai pazienti.

Durante il seminario, partendo dall’esperienza più che decennale del
CRS4 in ricerca e sviluppo per l’impiego di informatica e tecnologia in
campo medico, verranno presentate le attività di ricerca del
gruppo Healthcare Flows nell’ambito delle applicazioni
biomediche, dell’informatica clinica e della sanità elettronica,
anche in stretta collaborazione con istituzioni sanitarie di eccellenza.

In particolare si parlerà di integrazione di sistemi clinici, sicurezza e
tracciabilità nei processi sanitari, gestione semantica e computazionale
di dati biomedici eterogenei, medicina distribuita e telemedicina.

Relatore: Riccardo Triunfo
Relatore
Riccardo Triunfo
La “rivoluzione digitale”, in atto da anni in tutti i settori della vita quotidiana,
sta investendo in modo sempre più intensivo la medicina in generale e la pratica
CRS4 clinica: la tecnologia è ormai diventata un fattore pervasivo ed importante
nell’ambito dei processi di cura, contribuendo a migliorare l’assistenza ai pazienti.

Durante il seminario, partendo dall’esperienza più che decennale del CRS4 in

Info e iscrizione: www.crs4.it

Risorse online

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