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EFECTO DEL PROCESO DE VITRIFICACIÓN SOBRE LA ESTRUCTURA
DEL HUSO MEIÓTICO Y ORGANIZACIÓN CROMOSÓMICA EN
OVOCITOS HUMANOS EN METAFASE II
EFFECT OF VITRIFICATION PROCEDURE ON SPINDLE AND CHROMOSOME
CONFIGURATION IN METAPHASE II HUMAN OOCYTES
Cristina Costana Duque*1, Javier Alfonso2, Rita Cervera3, Ana Monzó1,2, Vicente Montañana 1,2, Miodrag Stojkovic3, Alberto Romeu 1,2
1
Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. 2Instituto de Medicina Reproductiva (IMER),
Valencia. 3Laboratorio de Reprogramación Celular, Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), Valencia.
*Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. Av/ Campanar 21, 46009, Valencia.
e-mail: cristinacostana@hotmail.com
Fecha recepción: 30 abril 2010 · Fecha aceptación: 3 mayo 2010
RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la técnica de vitrificación utilizando el método del Cryotip™ sobre la
integridad del huso meiótico y la organización cromosómica en ovocitos humanos en metafase II. La configuración del huso
meiótico y de la placa metafásica de los ovocitos frescos (control) y vitrificados se evaluó mediante microscopía confocal. La
tasa de supervivencia para los ovocitos desvitrificados fue del 91,6%. La proporción de ovocitos que mostró una configuración
normal del huso meiótico y de la placa metafásica fue similar en ovocitos frescos y vitrificados, sugiriendo que la técnica de
vitrificación con el Cryotip™ permite mantener el potencial de los ovocitos una vez desvitrificados. Rev Asoc Est Biol Rep 2010;
15(1):14-17.
Palabras clave: ovocitos metafase II, vitrificación, huso meiótico, organización cromosómica.
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the effect of vitrification procedure using the Cryotip™ method on spindle and
chromosome configurations in metaphase II human oocytes. The meiotic spindle and chromosome configurations in fresh
(control) and vitrified oocytes were studied by confocal microscopy. Survival rate for vitrified oocytes was 91.6%. The
proportion of oocytes showing normal spindle and chromosome configuration was similar for fresh and vitrified oocytes
showing that vitrification with the Cryotip™ method supports oocyte potential after warming. Rev Asoc Est Biol Rep 2010;
15(1):14-17.
Keywords: metaphase II oocytes, vitrification, meiotic spindle, chromosome configuration
INTRODUCCIÓN la sincronización donante-receptora en Los microtúbulos, que conforman el
ciclos de donación de ovocitos o, huso meiótico, y los microfilamentos,
La criopreservación de ovocitos permite simplemente, en mujeres fértiles que localizados en el córtex ovocitario, son
preservar la fertilidad en pacientes que deseen posponer la maternidad. muy susceptibles a la temperatura de
por diversas etiologías pueden enfriamiento (chilling) y a la exposición
desarrollar un Fallo Ovárico Prematuro La criopreservación ovocitaria utilizando a los crioprotectores (Boiso et al.,
(FOP). Es el caso de exposición a agentes la técnica de congelación convencional se 2002). Una alteración en estas
quimio/radioterápicos, enfermedades considera un procedimiento estructuras podría conducir a una
autoinmunes o hematológicas, o experimental, debido a las bajas tasas de alineación cromosómica incorrecta
procesos quirúrgicos potencialmente supervivencia y gestación y al limitado previa a la extrusión del corpúsculo
esterilizantes. La criopreservación número de recién nacidos logrado (ASRM, polar, a una segregación cromosómica
ovocitaria puede emplearse también 2006). Los protocolos de alterada, fecundación anómala y/o a una
para evitar la criopreservación de congelación/descongelación elevada incidencia de aneuploidías.
embriones, para rescatar ciclos convencionales conllevan una reducción
complicados con un síndrome de lenta de la temperatura en el tiempo, La vitrificación combina tasas de
hiperestimulación ovárica o con resultando en el daño de estructuras enfriamiento del orden de -15.000º C a -
ausencia de muestra seminal el día de la vitales de los ovocitos. 30.000º C por minuto (Liebermann et al.,
punción-aspiración folicular, para evitar 2003) y concentraciones elevadas de

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Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1
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crioprotectores, aumentando de tal hiperestimulación ovárica controlada compuestas por medio 199 con
manera su viscosidad que no cristaliza que incluyó, como frenado hipofisario, concentraciones decrecientes de
sino que forma un estado amorfo similar agonistas de la GnRH en protocolo largo sacarosa (1.0M y 0.5M).
al vidrio. y como estimulación FSH recombinante.
Los ovocitos se recuperaron por punción La supervivencia ovocitaria se evaluó
La técnica de vitrificación permite burlar transvaginal ecoguiada, 36-38 horas inmediatamente tras la desvitrificación
dos de los factores que limitan el éxito tras la administración de la hCG. Los y tras 4 horas de cultivo in vitro,
de la criopreservación: por un lado, el complejos cúmulo-ovocito fueron valorándose la integridad de la zona
proceso conocido como chilling injury cultivados en medio IVF (Universal IVF pelúcida, la apariencia del citoplasma y
(Vatja and Kuwayama, 2006) y, por otro, Medium, Medicult, Jyllinge, Denmark) la ausencia de lisis celular.
la formación de cristales de hielo en el bajo condiciones de cultivo estándar
interior de las células (Mazur, 1984). El (37º C y 5% de CO2). Tras al menos 2 Fijación y tinción inmunocitoquímica:
primero se define como el daño horas de cultivo in vitro, los ovocitos
irreversible tras la exposición de las fueron incubados con 80 IU/mL La fijación de los ovocitos y tinción
células a bajas temperaturas (de + 15º C hialuronidasa (Hyadase, Medicult, inmunocitoquímica del huso meiótico se
a -5º C) antes de que se produzca la Jyllinge, Denmark) y las células del realizó siguiendo el protocolo descrito
enucleación del hielo. En consecuencia, cúmulo fueron eliminadas mediante el por Lin et al. (2008).
estructuras celulares como el pipeteado mecánico de los ovocitos. Los
citoesqueleto o las membranas celulares ovocitos fueron entonces observados Brevemente, los ovocitos MII
se ven claramente afectadas. El utilizando un microscopio invertido desvitrificados y frescos (grupo control)
fenómeno del chilling puede minimizarse (x200) y los ovocitos MII se identificaron fueron fijados a 37ºC durante 1 hora en
durante el proceso de vitrificación por la presencia del primer corpúsculo una solución de formaldehído al 2% y
mediante el empleo de tasas de polar. permeabilizados en una solución de
enfriamiento elevadas (Liebermann et Tritón X-100 al 0.5% durante 30
al., 2003). La velocidad de enfriamiento Se vitrificaron un total de 12 ovocitos en minutos a temperatura ambiente. Para
de la muestra va a depender del volumen estadio de MII recuperados de pacientes la tinción de la tubulina, los ovocitos se
de la solución de vitrificación, así, a incluidas en el Programa de Fecundación incubaron durante 90 minutos a 37ºC en
menor volumen, mayor velocidad de in vitro del Instituto de Medicina una solución de anticuerpos primarios
enfriamiento, aumentando ésta Reproductiva (IMER) de Valencia que anti-α y anti-β tubulina (1/400), seguido
mediante la inmersión directa en firmaron el correspondiente de 3 lavados y se incubaron durante 120
nitrógeno líquido. Para evitar la consentimiento informado. Como grupo minutos a 37ºC en una solución de
formación de cristales de hielo, en la control (ovocitos MII no vitrificados), se anticuerpo secundario Alexa 488
técnica de vitrificación se emplean incluyeron 6 ovocitos procedentes de (1/200). Para la tinción de
elevadas concentraciones de pacientes pertenecientes al Programa de microfilamentos, los ovocitos se
crioprotectores (Liebermann et al., Fecundación in vitro de la Unidad de incubaron en una solución de rodamina-
2003), sin olvidar su efecto tóxico para Reproducción del Hospital Universitario faloidina durante 60 minutos a
las células. Sin embargo, una la Fe de Valencia, previa firma del temperatura ambiente. Finalmente, los
composición adecuada de consentimiento de participación en un ovocitos fueron montados utilizando
crioprotectores puede solventar los Proyecto de Investigación desarrollado en medio de montaje con DAPI y
efectos tóxicos y osmóticos debidos a la el Centro de Investigación Príncipe Felipe mantenidos a 4ºC hasta su evaluación.
alta concentración de crioprotectores en (CIPF) de Valencia y con licencia por parte
la solución de vitrificación. La mezcla de del Instituto de Salud Carlos III. Evaluación del huso meiótico:
crioprotectores más utilizada es la
formada por etilenglicol (EG), Protocolo de vitrificación: Para la valoración de los microtúbulos,
dimetilsulfóxido (DMSO) y sacarosa. microfilamentos y cromosomas, se
Para la vitrificación ovocitaria se utilizó utilizó un microscopio confocal con
El objetivo de este estudio fue evaluar el el kit comercial de Irvine Scientific con lasser-scanning (Leica DM IRE 2)
efecto de la criopreservación ovocitaria el Cryotip™ como contenedor. Los equipado con un láser de argón,
mediante la técnica de vitrificación con ovocitos fueron equilibrados en una perteneciente al Servicio de Microscopía
un sistema cerrado (Cryotip™) sobre la solución compuesta por 7.5 % (v/v) de Confocal del CIPF de Valencia.
integridad del huso meiótico y la DMSO + 7.5% (v/v) de EG + 20%
organización cromosómica en ovocitos suplemento sustitutivo de suero en RESULTADOS
humanos Metafase II (MII). medio 199. Posteriormente, fueron
expuestos a la solución de vitrificación Se vitrificaron y desvitrificaron 12
MATERIAL Y MÉTODOS compuesta por 15 % (v/v) de DMSO + ovocitos MII. La tasa de supervivencia
15% (v/v) de EG + 0.5M de sacarosa + fue del 91,6% (11/12). Todos los
Ovocitos MII: 20% suplemento sustitutivo de suero en ovocitos que sobrevivieron a la
medio 199 y cargados en el Cryotip™. desvitrificación mostraron una
A todas las pacientes que formaron parte Para la desvitrificación, los ovocitos apariencia morfológica normal tras 4
del estudio se les aplicó un protocolo de fueron expuestos a soluciones horas de cultivo in vitro.

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Cristina Duque et al. Efecto del proceso de vitrificación sobre la estructura del huso meiótico.
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Se fijaron para tinción correcta segregación cromosómica y AGRADECIMIENTOS
inmunocitoquímica 10 ovocitos MII evitar así la posible aparición de
desvitrificados y 6 ovocitos MII frescos. aneuploidías en el embrión. Aunque sólo Este estudio ha sido parcialmente
La tasa de ovocitos informativos fue del se observaron anomalías en el huso financiado por el Programa de Medicina
100% para el grupo control y del 70% meiótico/cromosomas en el grupo Regenerativa del Instituto de Salud
para los ovocitos desvitrificados. Esta de ovocitos desvitrificados, las Carlos III.
menor tasa de informatividad para diferencias no fueron estadísticamente
ovocitos desvitrificados fue debida a significativas respecto al grupo control REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
problemas acontecidos durante la (frescos). Estos resultados son similares
tinción, con independencia de la técnica a los descritos en la bibliografía (Li et Boiso I, Martí M, Santaló J. A confocal
de vitrificación. al., 2006; Cobo et al., 2008). microscopy analysis of the spindle and
chromosome configurations of human
En función de la orientación del La vitrificación utilizando el Cryotip™ oocytes cryopreserved at the germinal
complejo huso/cromosomas respecto al como contenedor permite la vitrificación vesicle and metaphase II stage. Human
plano focal, se consideró una de ovocitos en microvolúmenes (alrededor Reprod 2002; 17: 1885-1891.
configuración normal si: a) cuando al de 1 μL), incrementando la tasa de
estar orientado de forma paralela al enfriamiento y minimizando el efecto Cobo A, Pérez S, De los Santos MJ, Zulategui
plano focal el huso presenta una tóxico de los crioprotectores al disminuir J, Domingo J, Remohí J. Effect of different
estructura típica en forma de barril con su concentración. El mantenimiento de la cryopreservation protocols on the
los polos ligeramente señalados y los integridad del huso meiótico y de la placa metaphase II spindle in human oocytes.
cromosomas dispuestos en el ecuador, metafásica tras la desvitrificación sugiere Reprod Biomed Online 2008; 3: 350-359.
b) cuando al estar orientado de forma que dicha técnica de vitrificación permite
perpendicular al plano focal el huso preservar la calidad inicial del ovocito y el Li Y, Feng HL, Cao HL, Zheng GJ, Yang Y,
presenta una estructura circular con los potencial necesario para soportar el Mullen S, Critser JK, Chen ZJ. Confocal
cromosomas orientados en forma de posterior desarrollo embrionario. microscopic analysis of the spindle and
círculo y c) cuando al estar orientado de
forma oblicua al plano focal el huso
presenta una estructura en forma oval
(barril acortado) con los cromosomas
alineados en el ecuador. Por otro lado,
una configuración anómala del complejo
huso/cromosomas quedó representada
por una desorganización parcial o
completa de los microtúbulos o por una
dispersión cromosómica o apariencia
cromosómica aberrante o poco
condensada. En las Figuras 1 y 2 se
muestran una configuración normal y
una anómala del complejo
huso/cromosomas, respectivamente.
La proporción de ovocitos con una Figura 1: Configuración normal del complejo huso meiótico-placa metafásica.
configuración normal del huso meiótico
y una alineación correcta de los
cromosomas fue del 100% para los
ovocitos del grupo control y de 85,7%
para los ovocitos desvitrificados, sin que
se observaran diferencias significativas
entre ambos grupos.
DISCUSIÓN
En este trabajo se evalúa el efecto de la
técnica de vitrificación con un sistema
cerrado (Cryotip™) sobre la
configuración del huso meiótico y la
organización cromosómica en ovocitos
humanos en estadio de MII. La
integridad de este complejo es
imprescindible para que se produzca una Figura 2: Configuración anómala del complejo huso meiótico-placa metafásica.

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Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1
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