CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Y ULTRAESTRUCTURALES DE CIGOTOS Y EMBRIONES ANORMALES TRAS FIV / ICSI

F O R M A C I Ó N C O N T I N U A D A
M. Boada y M. Ponsá. Características morfológicas y ultraestructurales de cigotos y embriones anormales tras FIV/ICSI.
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CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Y ULTRAESTRUCTURALES
DE CIGOTOS Y EMBRIONES ANORMALES TRAS FIV / ICSI
Morphological and ultraestructural characteristics of abnormal zygotes and
cleavage embryos after IVF / ICSI

M.Boada (1), M. Ponsà (2) (1) Servicio de Medicina de la Reproducción. Departamento de Obstetricia y Ginecología. Institut Universitari Dexeus
(2) Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología. Universitat Autònoma de Barcelona. Dirección para correspondencia: Montserrat
Boada Servicio de Medicina de la Reproducción. Institut Universitari Dexeus Gran Vía Carlos III, 71-75 08028 Barcelona monboa@dexeus.com

RESUMEN
La presencia de dos pronúcleos y dos corpúsculos polares a las 16-22 horas post inseminación in vitro mediante FIV/ICSI, se
considera signo inequívoco de una correcta fecundación. Al realizar la valoración de la fecundación otros estados pueden
observarse como consecuencia de un fallo de fecundación, una fecundación anómala o un desarrollo incorrecto. En este trabajo
se describen las distintas situaciones anómalas que pueden observarse en las primeras fases de desarrollo embrionario:
3PN+2CP, 3PN+1CP, 2PN+1CP, 1PN+1CP, 1PN+2CP y No PN+2CP en D+1, así como los embriones parados en 2PN+2CP, embriones
fragmentados y embriones multinucleados en D+2 o D+3. Se detallan las características morfológicas y ultraestructurales de
cada caso y se describen los posibles orígenes y su posible viabilidad para la transferencia uterina.
Palabras clave: Ultraestructura / Desarrollo embrionario / Embriones humanos anormales / Polispermia / Fragmentación
celular / Multinucleación.

SUMMARY
The presence of two pronuclei and two polar bodies 16-22 hours after in vitro insemination (IVF/ICSI) is considered as the
unequivocal sign of correct fertilization. When fertilization is being evaluated, other stages can be observed as a consequence
of a fertilization failure, an anomalous fertilization or an abnormal development. In this paper we describe the different
anomalous situations that can be detected at the first stages of embryo development: 3PN+2PB, 3PN+1PB, 2PN+1PB, 1PN+1PB,
1PN+2PB and No PN+2PB at D+1, as well as embryos arrested at stage 2PN+2PB, fragmented embryos and multinucleated
embryos at D+2 or D+3. The morphological and ultrastructural characteristics of each case are described, together with their
possible origins and viability for uterine transfer.
Key words: Ultrastructure/ Embryo development/ Abnormal human embryos/ Polyspermy/ Cell fragmentation/ Multinucleation

La valoración de los ovocitos corpúsculos polares en el espacio y/o embriones no transferibles que
inseminados in vitro a las 16-22 horas perivitelino (2PN+2CP), al día siguiente deben ser descartados (ASEBIR, 2008).
post inseminación es el procedimiento de la inseminación (D+1), se considera
comúnmente aceptado para evaluar la el estado correspondiente a una CIGOTOS ANORMALES (D+1) 3PN+2CP
fecundación. No obstante, en ovocitos correcta fecundación, existen otras
inseminados por microinyección situaciones con las que podemos Generalmente el estado de 3PN+2CP
espermática (ICSI) la formación de encontrarnos generalmente como se produce en la inseminación
pronúcleos acostumbra a ser más consecuencia de procesos erróneos. mediante FIV convencional y el origen
rápida por lo que este periodo suele Una activación partenogenética del suele ser masculino (diándrico) como
restringirse a las 16-19 horas post ovocito, la polipenetración por parte de consecuencia de la fecundación por
inseminación para evitar una más de un espermatozoide o una parte de dos espermatozoides
observación excesivamente tardía en la reactivación anómala de la meiosis que (dispermia). La polipenetración por
que los pronúcleos ya hayan empezado comporte alteraciones en los procesos más de dos espermatozoides es menos
a desaparecer (ASEBIR, 2008). de formación de los pronúcleos y/o en frecuente pero también puede
la extrusión del segundo corpúsculo producirse cuando el fallo en el bloqueo
Si bien la observación de dos polar pueden originar situaciones que contra la polispermia ha sido mayor
pronúcleos más o menos centrados en en la mayoría de los casos se consideran (>3PN+2CP). Las causas de la
el interior del citoplasma y dos anómalas y en consecuencia, cigotos polipenetración tanto pueden ser por

Diciembre 2008 Vol. 13 · Nº 2
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inmadurez como por hipermadurez de fragmentado. En el segundo corpúsculo limita los GC se fusiona con la
los ovocitos tras inseminaciones con polar se observan los mismos orgánulos membrana plasmática (oolema) y el
co-incubaciones largas. También se ha citoplasmáticos que en el primero pero contenido de los gránulos se vierte al
relacionado la polipenetración con la no suelen observarse GC y el material espacio perivitelino iniciándose las
presencia de alteraciones de la zona nuclear se presente envuelto por reacciones químicas que provocan el
pelúcida ya sean naturales o membrana nuclear en forma de núcleo o endurecimiento de la zona pelúcida
producidas durante la manipulación, micronúcleos. (ZP) haciéndola menos vulnerable a los
con una incompleta reacción cortical, enzimas proteolíticos del acrosoma
con la edad de la paciente, con el En los ovocitos 3PN fruto de espermático. Los cambios producidos
protocolo de estimulación y con la una polispermia, se observan en la matriz extracelular producen una
concentración de espermatozoides esporádicamente algunos gránulos separación tanto física como bioquímica
utilizada en la inseminación (Austin, corticales residuales en la periferia del entre la célula y los espermatozoides
1974; Sathananthan and Trounson, citoplasma. Si la inseminación de los externos. Actualmente, observaciones
1982; Trounson et al., 1982; Ducibella ovocitos se ha realizado precozmente de microscopia electrónica y estudios
1996). (ovocitos inmaduros) es frecuente citoquímicos utilizando lectinas
observar los gránulos corticales en parecen indicar que en el oocito
En la inseminación por ICSI en la que regiones más internas del citoplasma humano existen diferentes tipos de GC
ciertamente se ha introducido un solo formando pequeñas agrupaciones (Fig. (Jimenez-Movilla et al., 2004) que
espermatozoide, la presencia de más de 2). En el ovocito maduro los GC se podrían desempeñar distintas
dos pronúcleos suele ser de origen funciones: modificación de la ZP para
femenino (digínico) y la observación evitar la reacción acrosómica,
de 3PN+2CP generalmente corresponde modificación de la membrana del
a una no extrusión del 2º corpúsculo ovocito evitando la fusión con la
polar y fragmentación o división del 1er membrana de otros espermatozoides, e
corpúsculo polar que se ha confundido incluso podrían estar relacionados con
con la presencia de dos corpúsculos procesos previos a la fusión de
polares. En realidad sería 3PN+1CP. membranas (Liu et al., 2003). Del
contenido de los GC se conoce que varia
La extrusión del 2º CP suele producirse según las especies demostrándose la
muy cerca de donde se encuentra el 1er presencia de determinados carbohidratos
CP que corresponde al polo animal del reactivos a las Lectinas y tipo N-
ovocito (Antezak and Van Blerkom, glycanos en los GC de la especie
1999). El primer corpúsculo polar se Figura 2. Detalle del citoplasma de un cigoto
humana (Jimenez-Movilla et al., 2004).
diferencia del segundo corpúsculo polar 3PN+2CP en el que se observa una agrupación de
por presentar gránulos corticales (GC), gránulos corticales situada cerca de los pronúcleos La falta o escasez de GC adyacentes
microtúbulos y material nuclear en (20.000X). a la membrana en los ovocitos
forma de cromosomas en su interior polipenetrados, indica que la reacción
(Fig. 1). Los orgánulos citoplasmáticos encuentran dispuestos en la periferia cortical ya se ha realizado cuando
debajo de la membrana plasmática. La se procede a la fijación de la muestra
formación de los GC ocurre en los para su estudio ultraestructural.
primeros estadios de la maduración de Generalmente se observan los dos
los ovocitos aunque el momento corpúsculos polares en el espacio
varía según las especies (Berg and perivitelino más o menos degenerados
Wessel, 1997). Se originan a partir del y/o fragmentados en función del tiempo
complejo de Golgi que se hipertrofia transcurrido antes de su fijación.
formándose unas vesículas de En el citoplasma, se observa una
contenido electrodenso que migran mayor concentración de orgánulos
hacia la periferia de la célula gracias a la citoplasmáticos alrededor de los
red de microfilamentos citoplasmáticos pronúcleos. Los orgánulos más
(Dimaggio et al., 1997, Wessel et al., abundantes son las mitocondrias que
2002). La migración de los GC y la son redondas o ligeramente ovales y con
maduración del ovocito son procesos pocas crestas, y las vesículas de retículo
Figura 1. Detalle del primer corpúsculo polar de un paralelos en la mayoría de las especies. endoplasmático liso (REL). Igual que en
cigoto parado en 2PN+2CP en el que se ven
cromosomas y algunos gránulos corticales Como consecuencia de la los ovocitos y otros cigotos no evolutivos
(5.000X). fecundación del ovocito por parte es frecuente observar asociaciones
de un espermatozoide, se produce de grandes vesículas de REL con
que presenta son los mismos que se normalmente la reacción cortical para mitocondrias redondas dispuestas a su
encuentran en el citoplasma del ovocito. evitar la polispermia. Durante la alrededor. También se observan de
Frecuentemente se observa dividido o reacción cortical, la membrana que forma esporádica, agrupaciones de gran

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tamaño de pequeñas vesículas de
retículo endoplasmático liso (AREL) (Fig.
3) que algunos autores relacionan con

Figura 4. Imagen ultraestructural de un cigoto Figura 6. Restos del flagelo de un espermatozoide
3PN+2CP en la que se observan los tres pronúcleos en la región del citoplasma próxima a los PN de un
con las estructuras intranucleares polarizadas hacia cigoto 3PN+2CP. En los pronúcleos se observan
la región donde convergen los pronúcleos (6.000X). invaginaciones de la membrana nuclear,
precursores nucleolares y fragmentos simples de
Figura 3. Detalle del citoplasma de de un cigoto láminas anilladas (12.000X).
3PN+2CP en el que se observa una agrupación de
pequeñas vesículas de retículo endoplasmático liso
(AREL) (12.000X).
que hay restos de distintos
espermatozoides aunque algunas
ovocitos envejecidos (Sathananthan imágenes parecen sugerirlo (Van
and Gunasheela, 2007). Al microscopio Blerkom et al., 1984; Boada and Ponsà
óptico, las AREL parecen grandes 1987; Boada 1992; Sathananthan et al.,
vacuolas aunque difieren de estas por 1999). La presencia de más de un
su aspecto translúcido y según se ha centrosoma espermático, estructura de
visto al microscopio electrónico de Figura 5. Paquete de láminas anilladas gran importancia en las primeras
transmisión (MET), por carecer de citoplasmáticas dispuestas paralelamente y divisiones mitóticas por actuar como
membrana que las delimite. Según su situadas junto a una mitocondria (26.000X). centro organizador de los microtúbulos
tamaño y posición, pueden llegarse a y encargado de dirigir la organización
confundir con un pronúcleo. La también en los cigotos (Fig. 5). Tienen de la placa metafásica y del
existencia de AREL podría ser unas características ultraestructurales citoesqueleto, puede comportar una
consecuencia de niveles elevados de como las de la envoltura nuclear segregación tripolar o una segregación
estradiol en el día de administración de observándose en sus cisternas totalmente desorganizada con dispersión
la hCG y su presencia se ha relacionado numerosos poros complejos. También de los cromosomas. En los 3PN+2CP
con bajas tasas de embarazo (Otsuki et pueden encontrarse en el interior del que pasan a dos células tras una
al., 2004). Estos autores sugieren que núcleo en forma de fragmentos simples, división aparentemente normal,
un patrón anormal en la formación y preferentemente convergiendo hacía la pero cromosómicamente anormal, la
distribución de REL podría comportar zona de confluencia de los pronúcleos. explicación más probable es que se
anomalías en el mecanismo de Esta característica se considera como haya producido una segregación
regulación del Ca2+ y por tanto llegar a un signo de apoptosis igual que una bipolar quedando uno de los dos
afectar el desarrollo embrionario. baja concentración de poros en la centrosomas espermáticos excluido del
Alteraciones en el mecanismo regulador membrana nuclear, típico de estados no proceso (Sathananthan et al., 1999).
del calcio que modifiquen las evolutivos (Rawe et al., 2003). La
oscilaciones que regulan la expresión presencia de pequeños complejos de La mayoría de los embriones con tres
del RNAm del ovocito pueden afectar la Golgi indica que ya hay actividad puesto pronúcleos no evolucionan, observándose
correcta formación y funcionamiento que en los ovocitos maduros parados en en su interior, signos estructurales
de los pronúcleos en el cigoto, metafase II, es raro observar vesículas típicos de degeneración como son:
comprometiendo la activación de la o cisternas de Golgi. Realizando un fragmentación citoplasmática, aumento
síntesis de RNA nuclear, la primera estudio secuencial de todo el cigoto y de vesículas de REL que evolucionan
síntesis de DNA durante la fase S y la tras una observación minuciosa del hacia vacuolas con mitocondrias
posterior unión de los dos genomas en citoplasma, se pueden observar restos asociadas y posición excéntrica de
un único genoma embrionario (Tesarik de los axonemas espermáticos con los los pronúcleos. Su capacidad de
et al., 2007). nueve pares de microtúbulos, los dos división es inferior a la de los cigotos
microtúbulos centrales y las nueve correctamente fecundados pero si se
En el interior de los pronúcleos, se fibras densas, mientras que no es dividen, los cambios que ocurren no se
observan pequeños grumos de cromatina posible identificar las mitocondrias distinguen de los que se producen en
y precursores nucleolares densos y procedentes de las piezas intermedias. los cigotos 2PN: migración de los PN,
compactos, polarizados hacia la zona que Generalmente, los restos espermáticos interdigitación de las envolturas
convergen los tres pronúcleos (Fig. 4). se encuentran muy cerca de los PN nucleares y posición convergente de la
Los paquetes de láminas anilladas (Fig. 6) y raras veces se han descrito cromatina, precursores nucleolares y
citoplasmáticas están presentes observaciones que permitan asegurar demás estructuras nucleares. Cuando se

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bloquean y no se dividen, las fecundación correcta por parte de un espermatozoide pero con ausencia de
características morfológicas son solo espermatozoide y la no extrusión formación de uno de los dos pronúcleos y
equivalentes a las de los cigotos del segundo corpúsculo polar que no extrusión del segundo corpúsculo
parados en estado de 2PN que no formaría un segundo pronúcleo de polar son menos probables. Igual que en
avanzan en el desarrollo embrionario. origen femenino (digínia). Las el caso anterior, únicamente la
El timing de división de los cigotos con características ultraestructurales de los observación de restos espermáticos o el
tres pronúcleos suele verse alterado 3PN+1CP son parecidas a los 3PN+2CP a estudio del material nuclear puede
(Van Blerkom, 1989), observándose diferencia de que en estos casos sólo esclarecer el origen de dichos cigotos que
normalmente retrasos (Sathananthan podrían encontrarse restos de un no deben considerarse para la
et al., 1999). La división de cigotos 3PN espermatozoide en el interior del transferencia uterina a pesar de que
genera frecuentemente blastómeros ovocito. Igual que los anteriores, estos generalmente no evolucionan más allá
multinucleados. Se ha visto que los cigotos pueden dividirse normalmente del estado de 6-8 células (Sathananthan
cigotos 3PN pueden llegar al estado de y llegar a término por lo que deben and Gunasheela, 2007).
blastocisto pudiendo incluso llegar a descartarse desde un principio para su
implantar ya que se conocen tanto utilización clínica. 1PN+2CP
fetos como recién nacidos triploides
(69XXX o 69XXY) (Edwards, 1986). Los 2PN+1CP La viabilidad de los cigotos 1PN +2CP
estudios citogenéticos de embriones varia según su origen. Mientras que los
polipenetrados demuestran que en Puede tratarse de una activación procedentes de FIV con inseminación
muchos casos se trata de mosaicos en partenogenética sin extrusión del convencional acostumbran a tener
los que coexisten blastómeros segundo corpúsculo polar y formación una dotación cromosómica diploide
normales y blastómeros con un número de dos pronúcleos femeninos (Kaufan, y en consecuencia son considerados
anómalo de cromosomas (Munné and 1983), o bien ser el producto de una generalmente como embriones
Cohen, 1998; Sathananthan et al,1999) fecundación normal por parte de un transferibles, los procedentes de ICSI
espermatozoide pero con la no se ha visto que solamente son
Es importante destacar que las extrusión del segundo corpúsculo polar cromosómicamente normales el 14-
observaciones al estereomicroscopio o por lo que el pronúcleo femenino 28% de los casos (Staessen and Van
al microscopio invertido si no se tendría dotación diploide y el cariotipo Steirteghem, 1997; Balaban et al.,
realizan con suficiente detenimiento, fetal correspondería a una triploidía. 2004) por lo que suelen considerarse
pueden en ocasiones llevar a Los fetos triploides de origen digínico como no aptos para uso reproductivo.
confusiones. Un cigoto fecundado suelen presentar retraso del
normalmente (2PN+2CP) que además crecimiento, macrocefália y placenta no Otsu y colaboradores (2004) postulan
presente grandes AREL, o una o más quística (Carceller et al., 2004). que cuando el pronúcleo mide 29 μm o
vesículas de tamaño similar al de los Únicamente el estudio cromosómico o más, lo más probable es que sea diploide
pronúcleos, puede interpretarse como molecular del material nuclear mientras que si el tamaño de éste es
un cigoto con tres o más PN. En permitiría establecer el origen de estos inferior, el cigoto es cromosómicamente
estos casos, una observación más casos que bajo ninguna circunstancia anormal en la mayoría de los casos.
precisa o por un embriólogo más deberían ser transferidos por el riesgo Generalmente, los 1PN+2CP de ICSI
experimentado permitiría distinguir el de patologías fetales que pueden son producto de una activación
pseudopronúcleo (PPN) de los comportar. Es importante realizar una partenogenética (Kaufman, 1983;
verdaderos pronúcleos. Los PPN se observación detallada antes de Balakier et al 1993) y raras veces (7%)
distinguen fácilmente de los PN por no descartar dichos cigotos con el fin de consiguen llegar a estado de blastocisto
presentar precursores nucleolares ni las confirmar la existencia de un solo (Campos et al., 2007). Su composición
modificaciones típicas de la membrana corpúsculo polar único y bien genética acostumbra a ser haploide (31-
en las regiones de convergencia de los diferenciado. 47%) (Balaban et al., 2004; Sultan
pronúcleos (Van Blerkom, 1987). Es et al., 1995) sin embargo en los
importante una observación detallada En el análisis ultraestructural al MET, la embriones que derivan de estas
y responsable ya que a diferencia de los visualización de restos espermáticos en estructuras también pueden encontrarse
3PN, el desarrollo de los cigotos con el interior del citoplasma constituiría la aneuploidias simples o complejas e
2PN y un pseudopronúcleo debería ser prueba irrefutable del origen no incluso mosaicos y embriones caóticos
normal. partenogenético de estos cigotos. (Campos et al., 2007).

3PN+1CP 1PN+1CP En general, la existencia de embriones
diploides procedentes de cigotos
La explicación de esta situación suele Generalmente se trata de una activación 1PN+2CP, fenómeno mucho más
ser la no segregación del 2º corpúsculo partenogenética sin extrusión del frecuente en FIV convencional que en
polar. Se presenta más frecuentemente segundo corpúsculo polar y formación de ICSI, puede tener distintos orígenes y
en casos de ICSI aunque también puede un solo pronúcleo femenino (Kaufman, suele interpretarse como consecuencia
darse en la FIV convencional. En estos 1983). Otras explicaciones como la de una fecundación normal pero con
casos correspondería también a una fecundación normal por parte de un asincronía en la formación de los dos

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pronúcleos que dificulta visualizarlos No PN+2CP observar estructuras espermáticas
simultáneamente (Sultan et al., 1995; en el interior del ovocito que confirman
Payne et al., 1997) o como La no observación de pronúcleos pero la penetración del espermatozoide.
consecuencia de la fusión del pronúcleo con presencia de dos corpúsculos Generalmente se observa la
masculino y femenino dando lugar a un polares frecuentemente se mal cataloga cromatina espermática más o menos
único pronúcleo diploide de gran como “no fecundado” (NF+2CP). Este descompactada y restos de la
tamaño (Levron et al., 1995). La estado es susceptible de distintas estructura axonemática del flagelo.
posibilidad de una diploidización interpretaciones aunque estudios También es posible observar fragmentos
temprana de cigotos haploides es la genéticos han demostrado que en un de membrana nuclear alrededor
explicación menos probable. 40% de los casos se trata de cigotos de los cromosomas del ovocito
diploides con una tasa de blastocisto de y/o de la cromatina espermática,
En FIV convencional, la observación de hasta el 56% lo que parece indicar que dispuestos desordenadamente indicando
cigotos con solo 1PN+2CP suele podría tratarse de embriones con una deficiencias en la formación de la
considerarse normal y se interpreta velocidad de división distinta (Campos membrana nuclear (Fig. 7).
como una asincronía en la aparición de et al., 2007). Para esclarecer la
los dos pronúcleos. Payne et al (1997) situación, en estos casos se requiere
observa sincronización en la formación una segunda observación al cabo de
de los dos pronúcleos en un 63% de los unas horas. Pasado este tiempo, si
casos. Para la formación del pronúcleo siguen sin observarse estructuras
masculino es necesario que se nucleares, se aconseja repetir la
descondense la cromatina espermática, observación a las 25-27 horas post
altamente compactada gracias a las inseminación para valorar la división
protaminas nucleares, mediante la temprana o early cleavage (EC).
acción de histonas ovocitarias. Una
disponibilidad insuficiente de histonas En caso de observarse división, la
puede comportar un retraso en la explicación más probable es que la
transformación del núcleo espermático fecundación hubiera sido muy Figura 7.- Detalle de la región del citoplasma donde
se encuentran los cromosomas de un ovocito en el
en pronúcleo masculino y con ello, una temprana y/o la velocidad de división que no se han visualizado pronúcleos (No PN+2CP),
asincronía de los pronúcleos. muy rápida por lo que en el momento de y en la que se observan fragmentos de membrana
valorar la fecundación, los pronúcleos nuclear dispuestos de forma anómala. (8.000X).
Para detectar los posibles casos de ya no fueran visibles y el cigoto se
asincronía, en los cigotos 1PN+2CP se estuviera preparando para la primera EMBRIONES ANORMALES EN ESTADOS
recomienda la realización de una división embrionaria. Si por el PRECOCES DE DIVISIÓN (D+2 /D+3)
segunda observación para constatar la contrario, a las 25-27 horas post
presencia o ausencia del segundo inseminación se observan por primera La valoración de las primeras divisiones
pronúcleo. Staessen et al (1993) vez los dos pronúcleos correspondería embrionarias debe realizarse a las 44-
observan que el 25% de estos cigotos a una fecundación tardía. 47 horas post inseminación en D+2 o a
forman un segundo pronúcleo las 67-71 horas en D+3. Los criterios
asincrónico al cabo de 4-6 horas. Cuando las observaciones se han para evaluar el desarrollo embrionario
realizado en el timing adecuado y en incluyen la valoración del número de
A pesar de que se haya demostrado que ningún momento se han observado los células o blastómeros, simetría,
un gran número de los cigotos 1PN+2CP dos PN y dos CP, no se puede excluir un presencia de núcleos y grado de
son cromosómicamente normales, si las posible origen partenogenético por lo fragmentación, como parámetros más
observaciones se han realizado en el que preferentemente se escogerán para significativos (ASEBIR, 2008). El
timing adecuado y no se observaron los la transferencia uterina, aquellos número y la semejanza de tamaño de
2PN+2CP, debe tenerse en cuenta que embriones en los que se hayan los blastómeros se consideran unos de
únicamente con microscopía óptica no observado los dos pronúcleos. los parámetros más importantes ya que
puede descartarse un posible origen la coexistencia de blastómeros de
partenogenético por lo que en igualdad Si no se observa división ni a las 25-27h distinta medida se relaciona con
de score embrionario, preferentemente post inseminación (EC D+1) ni al día elevadas tasas de aneuploidía y
se seleccionarán para la transferencia siguiente (D+2), la explicación más multinucleación (Hardarson et al.,
embriones en los que se hayan probable es la no fecundación del 2001).
observado los dos pronúcleos. Tan solo ovocito con división o fragmentación
la observación ultraestructural de del 1er CP o un paro muy precoz en el Existen distintos métodos para la
restos espermáticos en el interior del correcto desarrollo hacia el estado de clasificación y selección de los
citoplasma del cigoto o el estudio del cigoto, justo después de la extrusión embriones de mejor pronóstico
material nuclear puede esclarecer del 2º CP pero antes de la formación de basándose en la observación de dichos
definitivamente el origen de dichos los PN, lo que se conoce como una parámetros existiendo unanimidad en
casos. fecundación silenciada. En estos casos, considerar embriones de mal
el estudio ultraestructural permite pronóstico los que presentan una tasa

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de fragmentación superior al 25% y/o (Rawe et al., 2003). Entre las dos capas membrana de mayor electrodensidad.
multinucleación en alguna de sus de la membrana nuclear de los embriones Uniones celulares más complejas, gap y
células. parados en fase de pronúcleos se tigh junction, no empiezan a aparecer
observan frecuentemente pequeños hasta estadios más avanzados (Lopata
En D+2, el embrión debería estar en cuerpos ovales, electrodensos y con et al.,1983). La comunicación
estado de cuatro células o blastómeros membrana propia que los delimita. Se intercelular juega un papel importante
similares, fruto de dos divisiones encuentran preferentemente en la zona en la diferenciación celular. Parece
mitóticas. En D+3, una nueva división donde convergen los pronúcleos igual comúnmente aceptado que la
debería haberse producido en todas sus que los fragmentos de láminas anilladas polarización y diferenciación celular de
células dando lugar a un embrión de y otras estructuras nucleares. Son de los embriones se produce bajo control
ocho células. Embriones con un timing 0,15-0,30 μm y parece que se proyectan genético sin embargo, queda mucho
de división lento o excesivamente del núcleo hacia el citoplasma ya que es por conocer sobre los efectos de los
rápido se consideran embriones de mal la lámina externa de la membrana la distintos productos génicos que
pronóstico. Estados distintos suelen ser que se encuentra dilatada hacia el intervienen en dichos procesos
debidos a una mayor o menor velocidad citoplasma (Fig. 8) (Boada,1992). La (Scott, 2000). Tanoue y Takeichi
de división de las células así como a una (2004) describen la existencia de
asincronía entre ellas que origina la determinadas proteínas responsables
coexistencia de blastómeros de distinto de regular la organización del
tamaño, procedentes de distintas citoesqueleto de la periferia de las
divisiones o ciclos celulares. células, modulando así los contactos
entre blastómeros y la polaridad.
EMBRIONES PARADOS EN 2PN+2CP EN Estudios recientes en bovino sugieren
D+2 que la diferencia de longitud en los
puntos de contacto intercelulares
La ausencia de división es un fenómeno podría estar relacionada con el
que se produce ocasionalmente y comportamiento de los blastómeros al
corresponde a una interrupción del Figura 8.- Detalle de la membrana de uno de los inicio de la diferenciación celular
desarrollo en la transición entre la pronúcleos de un ovocito fecundado parado en (Bhojwani et al., 2007).
2PN+2CP en el que se pueden ver láminas anilladas
,
primera interfase y la primera mitosis. intranucleares y la presencia de cuerpos ovales que
En estos casos, la condensación del se proyectan hacia el citoplasma entre las dos Los orgánulos suelen distribuirse por
DNA en cromosomas, la rotura de la capas de la membrana nuclear (28.000X). todo el citoplasma aunque se observa
membrana nuclear y la formación del un ligero incremento alrededor del
huso mitótico bipolar no se producen presencia de estas vesículas o cuerpos núcleo y en algunos casos, una menor
(Asch et al., 1995). Algunos autores ovales intermembrana también se ha distribución en la región periférica de
correlacionan este fenómeno con observado en cigotos polispérmicos y en los blastómeros más externos en
cigotos con pronúcleos separados que embriones tempranos, y su función y contacto con la zona pelúcida, pero no
no consiguen disponerse en aposición contenido sigue estando por determinar. visible en la región del córtex
(Tesarik et al., 2007). Estudios de citoplasmático que se encuentra en
epifluorescencia lo asocian con EMBRIONES DIVIDIDOS aposición con otros blastómeros.
fenómenos de condensación anómala y Las mitocondrias siguen siendo
fragmentación del DNA no visibles con El estudio ultraestructural de preferentemente redondas, de matriz
microscopía óptica (Rawe et al., 2003). embriones humanos en D+2/ D+3 nos muy electrodensa con inclusiones y
muestra la presencia de blastómeros de pocas crestas normalmente aplanadas.
Estudios ultraestructurales de estos forma oval o redondeada de 75-85 μm Se observan también algunas
cigotos parados muestran un mayor de diámetro máximo y 50-60 μm mitocondrias alargadas y con crestas
número de paquetes de láminas de diámetro mínimo. La membrana transversales, típicas de estadios más
anilladas citoplasmáticas cerca de los citoplasmática es prácticamente lisa. Se avanzados con mayor actividad tras la
pronúcleos en comparación con los observan pocos microvilli en la región de diferenciación celular. Las mitocondrias
cigotos evolutivos, menor número de la membrana correspondiente a la parte pueden presentarse libres o
poros en la membrana de los del blastómero que queda libre mientras formando complejos con vesículas
pronúcleos, fragmentos de láminas que en la región que se encuentra en de retículo endoplasmático. El
anilladas atrapadas en el interior contacto con los otros blastómeros retículo endoplasmático se presenta
de los pronúcleos y presencia presenta más microvilli frecuentemente exclusivamente en forma de retículo
de numerosas mitocondrias con interconectados entre sí, uniones liso. Se observan vesículas de distintos
inclusiones. Dichas observaciones celulares primitivas y pequeñas vesículas tamaños (50-500 nm) distribuidas
sugieren una comunicación núcleo- ofragmentos citoplasmáticos de distinta por todo el citoplasma. Además de
citoplasma comprometida que podría electrodensidad. Generalmente, las los complejos vesícula–mitocondrias,
ser la responsable de la interrupción del uniones intercelulares son más también se observa REL asociado a las
desarrollo embrionario y de la ausencia abundantes en D+3 que en D+2 y se uniones intercelulares y a paquetes
de las primeras divisiones mitóticas observan como un engrosamiento de la de láminas anilladas, formando

33

continuidad con éstas. La frecuencia de el interior del núcleo se encuentran durante las primeras fases de
láminas anilladas es mucho menor en distintos precursores nucleolares de desarrollo embrionario y no se inician
los embriones que en los ovocitos o aproximadamente 2μm de diámetro hasta después de la fase de
cigotos. Se observan también algunos próximos a la membrana nuclear. En compactación. Sin embargo, estudios
complejos de Golgi en forma de embriones de 2-4 células, tienen forma más recientes demuestran que la
pequeñas asociaciones de túbulos que esférica y son extremadamente densos fragmentación podría estar regulada
se presentan de forma esporádica y y compactos similares a los que se por ciertos componentes del programa
aislada en el citoplasma de estos observan en los pronúcleos de los genético de la apoptosis como el gen
embriones. Puntualmente se observa la cigotos. En estadios posteriores (8-16 Caspase-3, inductor de la muerte
presencia de algún lisosoma secundario células), los nucleolos ya presentan un celular (Jurisicova et al., 2003).
en forma de cuerpo multivesiculado. En aspecto granular y reticulado, menos
la periferia del citoplasma se puede compacto y con menor electrodensidad Algunos autores atribuyen la
encontrar aisladamente algún gránulo indicativo de actividad nucleolar tras la reducida viabilidad de los embriones
cortical y paquetes de microtúbulos (40 activación de la expresión del genoma fragmentados a la presencia de
o más) dispuestos paralelamente entre embrionario (Lopata et al., 1983; fragmentos per se, sin embargo, los
sí y con la membrana citoplasmática. La Sathananthan, 1993). En el interior del beneficios de efectuar una extracción
presencia de microtúbulos en la núcleo se observan también pequeños de los fragmentos previamente a la
periferia de los blastómeros se agregados de heterocromatina de transferencia embrionaria parecen
relaciona con el importante papel que forma dispersa y en ocasiones, algún limitados. Según Alikani (2007),
éstos desempeñan durante la división fragmento simple de láminas anilladas únicamente se observa un aumento de
celular. En el citoplasma de los intranucleares. la tasa de implantación tras la
embriones de pocas células empiezan a aplicación de esta técnica en los
observarse también algunos ribosomas EMBRIONES FRAGMENTADOS embriones con 15-35% de fragmentos.
aunque la concentración de estos En los embriones con <15% o >35% de
orgánulos en forma libre o de polisomas La presencia abundante de fragmentos la influencia es menor en la
incrementa a medida que transcurren fragmentos citoplasmáticos puede mayoría de los casos ya sea por que la
las primeras divisiones embrionarias llegar a comprometer la viabilidad y fragmentación es muy leve y apenas
siendo muy abundantes en embriones potencial implantatorio del embrión. comporta consecuencias negativas para
de 14-16 células (Lopata et al., 1983). Dependiendo del tamaño y distribución el embrión o bien por que el daño es
La presencia de ribosomas al tercer día de los fragmentos, la existencia de excesivo y probablemente irreversible.
de desarrollo coincide con la activación fragmentación puede tener distinto
del genoma. En la especie humana, la pronóstico (Alikani and Cohen, 1995; Trabajos con video-filmaciones han
activación del genoma embrionario Alikani et al., 2000). Se ha sugerido demostrado que en algunos embriones
empieza en el estadio de cuatro células que algunos patrones de fragmentación la fragmentación puede considerarse
con la activación de la síntesis de RNA conllevarían la pérdida total o parcial como un episodio temporal que puede
nuclear y justo a continuación, de algunas proteínas reguladoras reducirse o incluso desaparecer al cabo
entre cuatro y ocho células, empiezan específicas de los blastómeros lo de algunas divisiones celulares.
a aparecer los primeros signos que podría comportar consecuencias También se ha constatado que los
bioquímicos y morfológicos de la negativas para el desarrollo embriones mitóticamente inactivos no
expresión génica embrionaria (Tesarik embrionario tanto de los blastómeros se fragmentan por lo que el proceso de
et al., 2007). Si bien durante los fragmentados como del embrión en su fragmentación se relaciona únicamente
primeros tres días el embrión sobrevive totalidad (Antezak and Van Blerkom, con las células en división (Alikani,
mayoritariamente gracias a las reservas 1999). 2007).
ovocitarias y según estudios recientes,
también a los RNAm que aporta el Algunos autores relacionan la Los fragmentos son de origen
espermatozoide (Ostermeier et al., fragmentación con fenómenos citoplasmático y están delimitados por
2004; Ambartsumyan y Clark, 2008), a apoptóticos (Jurisicova et al., 1996) membrana citoplasmática lisa en la que
partir de este momento debe iniciarse aunque la existencia de dicha relación prácticamente no se observan
la actividad transcripcional del DNA del sigue siendo controvertida. Estudios microvilli. Tampoco se observan uniones
propio embrión. realizados con Anexina V, proteína que los conecten entre sí ni con los
calcio-dependiente con gran afinidad blastómeros. Según su tamaño pueden
El núcleo de los blastómeros es poco por los fosfolípidos internos de la llegarse a confundir con un blastómero
electrodenso, tiene forma esférica (20- membrana citoplasmática, parecen o con los corpúsculos polares aunque se
25μm) y suele estar en el centro de la indicar que no existe correlación distinguen de ellos por ser anucleados y
célula. La membrana nuclear es doble (Antezak and Van Blerkom, 1999). por presentar formas variadas. Por lo
con numerosos poros y dilataciones Según un estudio de Spanos y general, los fragmentos no presentan
de la membrana externa en las colaboradores (2002) en el que ningún tipo de material nuclear en su
que se encuentran pequeños cuerpos evalúan la capacidad fagocitaria interior y el citoplasma contiene los
ovales (Dvorak et al.,1982; de los blastómeros, los fenómenos mismos orgánulos citoplasmáticos que
Sathananthan, 1984; Boada, 1992). En apoptóticos se encuentran inhibidos el de los blastómeros aunque la

34

distribución suele ser distinta. Los anómalos como la polispermia (Van embrionario como por ejemplo cambios
orgánulos se concentran en Blerkom et al., 1984) fruto de una en la temperatura (Winston et al.,
determinadas zonas de los fragmentos segregación anómala (Kola and 1991), determinados medios de cultivo
dejando regiones sin orgánulos que se Trounson, 1989, Sathananthan et al., (Pickering et al., 1995) o incluso los
observan como regiones más claras que 1999), el cese del desarrollo fármacos empleados en la estimulación
en ocasiones pueden tener forma de embrionario o la fragmentación del ciclo ovulatorio (De Vincentiis et
anillo y abarcar toda la región citoplasmática (Van Royen et al., al., 2005).
periférica del fragmento, similar al 2003). También puede detectarse en
anillo acitoplasmático que se observa embriones sin ningún otro signo de Existen distintos patrones de
en los blastómeros en procesos anormalidad morfológica (Fig. 10). multinucleación que tienen en cuenta el
degenerativos (Veeck, 1999), o número de células afectadas, el número de
incluso ocupar prácticamente todo el núcleos que se observan y el día de
fragmento (fragmentos de aspecto desarrollo en el que se detecta la
vacío). La electrodensidad de los anomalía. Según el patrón de
fragmentos suele ser variable multinucleación, el pronóstico del
pudiéndose encontrar en un mismo embrión será distinto. Meriano et al
embrión, fragmentos más oscuros que (2004) distingue dos fenotipos
otros que en cortes semifinos se embrionarios distintos según presenten
observan con diferente grado de blastómeros binucleados o multinucleados
tinción (Fig. 9). y encuentra mayor tasa de embarazo
transfiriendo embriones con blastómeros
binucleados (48%) en comparación con los
multinucleados (15.4%).
Figura 10.- Corte semifino de un embrión
multinucleado en estado de cuatro células
procedente de un cigoto 2PN+2CP. En la imagen se La observación de la división
observan tres blastómeros, uno de ellos con dos temprana (EC) en la tarde del D+1
núcleos. permite detectar los primeros
blastómeros multinucleados. Kligman y
Distintos estudios han reportado una colaboradores (1996) describen que el
incidencia variable de blastómeros 70% de las células con multinucleación
multinucleados de hasta el 74% en en D+2/D+3 presentan tres o más
embriones de D+2/D+3 procedentes de núcleos mientras que en estadios más
cigotos 2PN+2CP (Gil et al., 2007). avanzados (D+4) suelen ser
binucleadas. Dichos autores postulan
Figura 9.- Corte semifino de un embrión
Mayoritariamente, la multinucleación que la multinucleación en D+2/D+3
fragmentado en el que se observa una distribución
variable de los orgánulos y diferente grado de se considera fruto de la ausencia de produce mayoritariamente embriones
tinción entre los fragmentos. división citoplasmática (citocinesis) cromosómicamente anormales mientras
tras una replicación mitótica del que si se observa en D+4 o estadios
EMBRIONES MULTINUCLEADOS material nuclear, división nuclear posteriores, la mayoría de los
(cariocinesis) o fragmentación del embriones serán cromosómicamente
A pesar de que algunos autores habían núcleo (Lopata et al., 1983, Hardy normales.
sugerido que la multinucleación podría et al.,1993). Según Tesarik et al.,
ser un fenómeno temporal y reversible (1987), este fenómeno se produce También se han descrito embriones
de la división celular (Staessen and Van por una migración deficiente de multinucleados en los primeros
Steirteghem, 1998), la presencia de los cromosomas durante la anafase estadios de desarrollo embrionario que
multinucleación se correlaciona mitótica que comportaría la posteriormente son mononucleados
directamente con un incremento en la aparición de grupos aislados de (Gil et al., 2007) y distintos autores han
tasa de aneuploidias y mosaicismo cromosomas que posteriormente reportado el nacimiento de niños sanos
(Sathananthan et al., 1999; Hardarson quedarían individualmente envueltos a partir de la transferencia de
et al., 2001) por lo que los embriones por membrana nuclear formando embriones multinucleados (Balakier
que la presentan se consideran de mal distintos núcleos o micronúcleos. La and Cadesky, 1997; Jackson et al.,
pronóstico y existe consenso en presencia de blastómeros multinucleados 1998; Pelinck et al., 1998). La
considerarlos como no transferibles por puede tener distintos orígenes siendo explicación a este fenómeno de
lo que deberían excluirse para la los más probables los defectos reparación o corrección de la
transferencia uterina a menos que no en el citoesqueleto o en la placa multinucleación también es muy
exista ningún otro embrión de mejor metafásica del ovocito o blastómero y variada e incluye distintas hipótesis
pronóstico (Gil et al., 2007) las anomalías en el centrosoma como la recuperación en divisiones
espermático. Se han relacionado con el posteriores de la citocinesis, la fusión
En muchas ocasiones la multinucleación fenómeno de la multinucleación: las posterior de los núcleos derivados
se presenta asociada a otros fenómenos condiciones no adecuadas de cultivo inicialmente de un mismo núcleo

35

(Kligman et al., 1996) y la relegación al Alikani M, Calderón G, Tomkin G, Garrisi J, the sea urchin translocate early in oocyte
trofectodermo de las células Kokot M, Cohen J. Cleavage anomalies in maturation. Development 1997;124:1845-
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El volumen de los blastómeros Alm H, Torner H, et al. Ultraestructural
multinucleados es significativamente Alikani M. The origins and consequences of analysis reveals differences of intracellular
mayor que el de sus blastómeros fragmentation in mammalian eggs and contact lengths in bovine embryos
hermanos. Los análisis morfométricos embryos. En: Elder K, Cohen J, editors. produced in vivo, in vitro and by somatic
demuestran que los blastómeros Human preimplantation embryo selection. cell nuclear transfer. Mol Reprod Dev
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Los núcleos de las células multinucleadas
suelen ser de menor tamaño que los de las Antezak M, Van Blerkom J. Temporal and Boada M, Ponsà M. Ultrastructural studies
células mononucleadas (Lopata et al., spatial aspects of fragmentation in of human zygotes. En: Egozcue J, Barberá-
1983) aunque frecuentemente se early human embryos: possible effect Guillem E, editors. Cellular aspects of in
observan núcleos de distinto tamaño en on developmental competence and vitro fertilization. Cell Biology Reviews.
un mismo blastómero. Los núcleos suelen association with the differential elimination Leioa-Vizcaya: Springer International;
ser redondos aunque a veces pueden ser of regulatory proteins from polarised domains 1987. p. 32-38.
ovales e incluso lobulados. La membrana Hum Reprod 1999;14:429-447.
nuclear presenta múltiples poros y la Campos G, Parriego M, Vidal F, Coroleu V,
presencia de pequeños cuerpos ovales Asch R, Simerly CS, Ord T, Ord VA, Schatten Veiga A. Análisis cromosómico y potencial
entre las dos capas de la membrana que en G. The stages at which human fertilization de desarrollo de cigotos monopronucleares y
ocasiones son de mayor tamaño y menor arrests: microtubule and chromosome apronucleares. Rev Iberoam Fertilidad
electrodensidad que los observados en los configurations in inseminated oocytes 2007;24:29-34.
pronúcleos. Una característica particular which fail to complete fertilization and
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los pronúcleos de los cigotos hacia la zona II Criterios ASEBIR de valoración
de convergencia de estos, las estructuras morfológica de oocitos, embriones De Vincentiis S, Nodar F, Lavolpe M, Fiszbajn
nucleares de los distintos núcleos de un tempranos y blastocistos humanos. 2ª G, Rawe V, Brugo Olmedo S. Embryo
mismo blastómero no presentan esta edición. 2008. multinucleation (MNC) and clinical outcome:
tendencia a polarizarse de forma Its relationship with the use of agonists and
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