PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA E QUÍMICA FORENSE

TÉCNICA DE QUIMIOLUMINE...
Chemiluminescence technique in bloodstains:
The use of luminol for identification

ABSTRACT
Bloodstains in the crime scene...
partir de rearranjos moleculares (intermediários da reação). O tempo da reação
quimioluminescente e a duração da emissão d...
A partir do exposto, o objetivo desse trabalho foi realizar uma revisão bibliográfica a
respeito das propriedades do reage...
DESENVOLVIMENTO
A perícia científica

É crescente o papel que a ciência desempenha nas investigações criminais
(RODRIGUES;...
dióxido de carbono que será eliminado na respiração (ALMEIDA, 2009). É constituído
pelo plasma, a fase líquida do sangue, ...
Figura 1 – Estrutura do complexo hexacoordenado (Fe2+ com seis ligações)
hemoglobina/oxigênio. Fonte: BARNI et al (2007).
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LUMINOL: OBTENÇÃO E AÇÃO

O luminol (5-amino-2,3-diidroftalazina-1,4-diona) é um reagente mundialmente
conhecido por suas ...
No mecanismo mais provável aventado para descrever a reação mais simples do
luminol em meio aquoso, um metal de transição ...
oxirredução catalisadas em um primeiro momento por enzimas de sua própria estrutura
celular e, também, por aquelas present...
aquelas que foram testadas com o reagente (PONCE et al, 2002), o que demonstra que o
luminol não interfere na análise de D...
que a luminescência gerada pelo hipoclorito não possui o mesmo comprimento de onda
(430 ± 3 nm) daquela gerada pelo grupo ...
Estudos recentes apontam sua capacidade de detectar traços de sangue depositado no solo
após seis anos de exposição ao ar ...
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SANTOS, Roberto Márcio Souza; SANTOS, Maiza Ferreira; COSTA, Maria de Fátima Dias.
Quimiolumine...
VILLEGAS, MR.; ACEVEDO, ML.; MIRANDA, J.; PINTO, EA. Validación de técnicas
para detección de sangre, sangre humana y grup...
imunológica
de
indivíduos
portadores
de
HIV.
Disponível
em:<http://ibpefex.com.br/site/images/stories/PFEX_04_JUL_AGO_2007...
QUICKENDEN, Terence I.; COOPER, Paul D. Icreasing the specificity of the forensic
luminol
test
for
blood.
Disponível
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  1. 1. PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA E QUÍMICA FORENSE TÉCNICA DE QUIMIOLUMINESCÊNCIA EM MANCHAS DE SANGUE: O USO DE LUMINOL PARA A SUA IDENTIFICAÇÃO Ananza Vidotto1 Paulo Roberto Queiroz2 1 Química. Aluna de Pós-Graduação em Farmácia e Química Forense, pela Universidade Católica de Goiás/IFAR. 2 Biólogo. Doutor em Biologia Animal pela Universidade de Brasília – UnB Professor do IFAR/PUC-GO. Endereço: IFAR – Instituto de Estudos Farmacêuticos. SHCGN 716 Bl B Lj 05 Brasilia – DF CEP: 70770-732. E-mail: pqsilva@uol.com.br RESUMO Manchas de sangue em um local de crime podem revelar muito acerca de sua natureza: a dinâmica dos fatos, de que modo o agressor chegou e deixou o local, que tipo de instrumento utilizou para cometer o delito. Os vestígios deixados na cena do crime ficam expostos a diversos fatores que podem comprometer sua conservação, desde aqueles do próprio ambiente, como chuva, calor e umidade, até a manipulação humana com a intenção de encobri-los para dificultar sua localização pela polícia e a consequente descoberta do fato. É importante, dessa forma, identificar o que pode ou não ser sangue no local do crime. Para isso, existem os chamados testes presuntivos, que devem ser sensíveis e precisos para detectar a presença do material procurado mesmo depois de algum tempo da ocorrência do fato e em condições adversas de conservação, dentre os quais se destacam a fenolftaleína, a tetrametilbenzidina e o luminol, que chama a atenção por se tratar de uma reação quimioluminescente catalisada pelo ferro presente no grupamento heme do sangue. A eficiência do luminol em testes para a detecção de sangue tem sido bastante estudada em diversos suportes e sob diferentes condições, e tem-se comprovado que, apesar de caro, é um método bastante útil e eficaz. Palavras-Chave: Luminol. Quimioluminescência. Manchas de sangue. Criminalística.
  2. 2. Chemiluminescence technique in bloodstains: The use of luminol for identification ABSTRACT Bloodstains in the crime scene might reveal many things about its nature: the dynamics of the incident, how did the aggressor arrive and leave the place, what kind of tool did he use to commit the wrongdoing. The vestiges left in the crime scene remain exposed to many factors that may endanger its conservation, since those from the surrounding, like rain, heat, and humidity, until human manipulation, intending to hide them to make more difficult its location by the police and the consequent disclosure of the fact. Therefore, it is important identify what may be or may be not blood at crime scene. For this, there are tests known as presumptive, that must be sensitive and accurate to detect the presence of the searched material even some time after the fact had happen and in bad conditions of conservation, for example phenolphthalein, tetramethylbenzidine and the luminol, that draws the attention for being a chemiluminescent reaction catalyzed by iron present in heme group of the blood. The effectiviness of luminol in tests for detecting blood has been widely studied in several supports and under different conditions, and has been confirmed that, even though it is expensive, it is a useful and efficient method. Keywords: Chemiluminescence. Luminol. Bloodstains. Crimiminalistics. INTRODUÇÃO A luminescência, um termo geral utilizado para designar diversos processos de emissão de luz, é um fenômeno bastante instigante e estudado desde os tempos mais remotos. Ocorre quando elétrons excitados após a absorção de uma determinada quantidade de energia emitem radiação luminosa ao retornarem ao seu estado fundamental, sem que uma parte significativa dessa energia se perca, se dissipando na forma de calor (DIAS, 2001; MENEZES, 2010). Essa energia eletromagnética é emitida por moléculas que possuem comprimento de onda na região localizada entre o infravermelho (800 nm) e o ultravioleta (400 nm) no conhecido espectro eletromagnético (SANTOS; SANTOS; COSTA, 1992; FERREIRA; ROSSI, 2002). A quimioluminescência, de acordo com Leite et al. (2004) é um subtipo de luminescência em que a energia de excitação do elétron para a produção da radiação luminosa advém de uma reação química, ou seja, a produção de luz ocorre devido a quebra de ligações ricas em energia já existentes na molécula que reage ou formadas a
  3. 3. partir de rearranjos moleculares (intermediários da reação). O tempo da reação quimioluminescente e a duração da emissão da radiação são variáveis de acordo com a natureza do material que a emite e, de acordo com Ferreira; Rossi (2002) variam de períodos muito pequenos (menores que 1 s) até muito longos (cerca de 1 dia). A quimioluminescência tem sido amplamente utilizada em diversos tipos de ensaios laboratoriais, destacando-se nas últimas décadas na criminalística com a utilização de compostos que produzem reações quimioluminescentes instantâneas ao entrarem em contato com tecidos biológicos que podem ser facilmente encontrados em locais nos quais um crime contra a pessoa tenha sido praticado como sêmen e, principalmente, sangue. O luminol é um composto que possui poderosas propriedades quimioluminescentes mediante oxidação que são caracterizadas pela emissão de luz azulada (MENEZES, 2010). De acordo com Navarrete et al. (2005), a quimioluminescência do luminol em meio aquoso básico, ocorre em presença de um reagente oxidante (H2O2, O2, HOCl) e, normalmente, de um metal de transição ou certos íons inorgânicos. Ele é amplamente utilizado em todo o mundo para testar a presença de sangue, uma vez que, o grupo heme, mesmo em quantidades mínimas, também é capaz de catalisar sua oxidação em solução alcalina (GROSS; HARRIS; KALDUM, 1999; LEITE; FATIBELLO-FILHO; ROCHA, 2004; BARNI et al, 2007). Não obstante, em um local de crime os vestígios nem sempre estão evidentes. Fatores ambientais e, principalmente, manipulações intencionais influenciam em seu estado de conservação (PITARCH et al., 2010), o que pode dificultar e muito a sua localização e identificação, ou mesmo uma coleta para posteriores análises laboratoriais que serão valiosas no eventual processo criminal que seguirá a fase de investigação. A aplicação da quimioluminescência em criminalística vem ganhando popularidade nas últimas décadas, inclusive com ampla divulgação pela mídia, tanto em jornalismo informativo quanto em seriados policiais televisivos de grande sucesso, que destacam a utilização do reagente luminol para a comprovação da presença de sangue em locais de crime, em supostas armas utilizadas para cometê-los, roupas de pessoas suspeitas, entre diversos outros itens relacionados ao fato delitivo, mesmo depois de limpos e lavados.
  4. 4. A partir do exposto, o objetivo desse trabalho foi realizar uma revisão bibliográfica a respeito das propriedades do reagente luminol para a detecção de vestígios hemáticos para análises forenses. METODOLOGIA Para a elaboração deste trabalho de revisão foram utilizados artigos, dissertações de mestrado e teses de doutorado publicados nos últimos anos acerca do composto químico luminol, suas propriedades quimioluminescentes e sua aplicação e utilidade no campo da criminalística. O levantamento bibliográfico foi realizado utilizando-se bases de dados, tais como, Scielo, Bireme, ScienceDirect e Portal de Periódicos CAPES. Além disso, foram obtidos dados provenientes de sítios de internet de Universidades do Brasil e de Portugal, assim como, da revista Química Nova. Foram utilizados os seguintes termos descritores: luminol, local de crime, quimioluminescência, manchas de sangue, criminalística, perícia criminal e testes presuntivos. Foram também consultados artigos disponíveis na Forensic International Academy of Public Safety (http://www.iapsonline.com/forensic), nos quais foram inseridos os descritores luminol, crime scene, chemiluminescence, presumptive tests. O material foi pesquisado, organizado e analisado no período compreendido entre 14 de fevereiro e 05 de maio do corrente ano, e foi selecionado observando-se a compatibilidade entre seu conteúdo e os tópicos de relevância para a discussão a ser realizada. Foram consultados para a realização do trabalho, no total, vinte e oito artigos, sendo artigos publicados em língua portuguesa, inglesa e espanhola. Também foram utilizadas dissertações de mestrado, tese de doutorado e uma dissertação de pósgraduação latu sensu.
  5. 5. DESENVOLVIMENTO A perícia científica É crescente o papel que a ciência desempenha nas investigações criminais (RODRIGUES; SILVA; TRUZZI, 2010). Com a legislação a cada dia mais voltada à proteção dos direitos humanos, deve-se salvaguardar a integridade física humana não se concebendo ao profissional de polícia moderno a obtenção de uma confissão de um agravo por parte de um eventual suspeito por meios insidiosos ou cruéis. Dessa forma, torna-se necessário que as técnicas utilizadas para a comprovação do fato em questão enveredassem ainda mais pelo caminho da ciência e da tecnologia, utilizando métodos rigorosos e que forneçam resultados tão precisos quanto possíveis, sob pena de não terem valia perante o tribunal caso os vestígios coletados no local de crime durante a investigação não sejam tratados adequadamente (DUARTE, 2010). Nesse sentido, as mais importantes descobertas do mundo científico são aplicadas em criminalística para elucidar toda espécie de delito. Crimes mais violentos, como homicídio, por exemplo, costumam apresentar sinais evidentes e, em muitos casos, pode não ser difícil para o perito realizar a identificação e coleta de indícios no local, como pegadas ou sangue. Contudo, com o decorrer do tempo, tais vestígios, principalmente os biológicos, podem perder propriedades importantes para confiabilidade dos testes que serão realizados para fins forenses, seja por fatores ambientais aos quais eventualmente estejam expostos até o momento em que são encontrados, ou pela manipulação humana, com a intenção de limpá-los para que o fato ocorrido seja encoberto (PITARCH et al, 2010). Dentre os vários tipos de vestígios encontrados em locais onde ocorreu um crime, os hematóides são os mais comuns. O SANGUE O sangue é um tecido que desempenha diversas funções imprescindíveis no organismo humano, sendo uma das principais transportar oxigênio aos demais tecidos e carrear o
  6. 6. dióxido de carbono que será eliminado na respiração (ALMEIDA, 2009). É constituído pelo plasma, a fase líquida do sangue, composta principalmente por água, proteínas, gorduras e sais orgânicos e minerais, que corresponde a mais de 50% de seu volume total; as plaquetas, que são produzidas na medula óssea, são anucleadas e têm função de colaborar na coagulação sanguínea de forma mecânica em caso de lesões vasculares (LEITE; SILVA JUNIOR; MIRANDA, 2007); os leucócitos, também são produzidos na medula óssea e sua principal atuação se dá no sistema imunológico (SANTOS et al, 2007); e os eritrócitos, mais conhecidos por hemácias, que contêm a hemoglobina e cuja função é efetuar o transporte do oxigênio dos pulmões aos tecidos e do gás carbônico no sentido inverso. A coloração do sangue depende da concentração de oxigênio dissolvido nele: escarlate, quando contém uma boa quantidade do gás; até vermelho escuro, quando a quantidade de oxigênio é baixa e a concentração de dióxido de carbono é mais elevada (MONTEIRO, 2010). A hemoglobina, componente primordial das hemácias, é um complexo hexacoordenado responsável pela condução de oxigênio aos tecidos do organismo, e é composta por uma porção protéica, chamada globina, e quatro cadeias polipeptídicas ligadas cada uma a um grupamento prostético heme (ALMEIDA, 2009). A estrutura da globina é composta por dois pares de cadeias polipeptídicas – cadeia alfa e cadeia beta. A cadeia alfa é formada por 141 resíduos de aminoácidos, e a cadeia beta pela junção de 146 resíduos de aminoácidos. Os grupamentos heme consistem em complexos de coordenação protoporfirínicos-Fe2+, em que o ferro encontra-se ligado ao centro do anel porfirínico por quatro átomos de nitrogênio, restando dessa forma duas posições axiais de coordenação – uma delas é preenchida pela ligação com a globina, enquanto a outra permanece livre para um ligante exógeno, que em geral será o oxigênio (BARNI; LEWIS; BERTI; MISKELLY; LAGO, 2007). Esta estrutura pode ser visualizada na figura 1.
  7. 7. Figura 1 – Estrutura do complexo hexacoordenado (Fe2+ com seis ligações) hemoglobina/oxigênio. Fonte: BARNI et al (2007). Manchas de sangue são de extrema importância em uma investigação criminal: é possível identificar vítimas e suspeitos, averiguar se o volume de sangue encontrado é compatível com o ferimento e até verificar a presença ou dosagem de drogas. Todavia, para que isso seja possível, faz-se necessário primeiramente certificar-se de que tais manchas encontradas tratam-se realmente de sangue (FILHO; ANTEDOMENICO, 2010). Para isso, existem testes utilizados para a detecção inicial da presença do que pode potencialmente ser sangue, são os chamados testes de presunção. Segundo Shanan; Watson; Daéid (2007), para que tais testes sejam considerados bons, devem englobar propriedades como rapidez, segurança, sensibilidade e especificidade, além de não reagir com a amostra e terminar por contaminá-la, interferindo em posteriores análises, como a de DNA. Existem testes de natureza quimioluminescente, que são mais empregados em locais nos quaqis há a suspeita de que houve sangue, para tornar visíveis manchas em regiões que passaram por processos de limpeza e revelar vestígios que devido ao tempo transcorrido já encontram-se irreconhecíveis pela observação (MONTEIRO, 2010). Dentre os testes de presunção utilizados para o sangue estão a fenolftaleína, o reagente de benzidina, o negro de amido e o luminol.
  8. 8. LUMINOL: OBTENÇÃO E AÇÃO O luminol (5-amino-2,3-diidroftalazina-1,4-diona) é um reagente mundialmente conhecido por suas propriedades quimiolumiescentes e é popular pela eficácia na detecção de sangue (MONTEIRO, 2010), muito bem caracterizada pela imediata emissão de luz azul ao entrar em contato com o referido tecido. Ele foi sintetizado pela primeira vez pelo químico alemão H. O. Albrecht, em 1928 e foi o primeiro composto a ser utilizado para a identificação de manchas de sangue, em meados dos anos 30 do século passado (MENEZES, 2010; MONTEIRO, 2010). Atualmente, um dos principais métodos para a sua obtenção é por meio da reação da hidrazina com o ácido 3-nitroftálico, mediante aquecimento (CHEMELLO, 2007), com a posterior redução do grupamento nitro do 5nitroftalhidrazina para a formação do produto final, conforme demonstrado na figura 2. A B C D Figura 2 – Reação de síntese do luminol a partir do ácido 3-nitroftálico. Em, A) Ácido 3Nitroftálico; B) Hidrazina; C) 5-Nitroftalhidrazina; D) Luminol. Fonte: MONTEIRO (2010). Existem diversos mecanismos propostos por autores distintos para explicar a reação quimioluminescente do luminol, e a maior parte das etapas mecanísticas já está elucidada e é bem compreendida, contudo ainda restam alguns detalhes sob discussão, como a formação de estados intermediários eletronicamente excitados (FERREIRA; ROSSI, 2002). Explorar esse ponto. A reação, para ocorrer, necessita de um agente oxidante – o mais comumente utilizado é o peróxido de hidrogênio – e um catalisador – utiliza-se normalmente um metal de transição. Pode ser realizada em alguns tipos de solventes orgânicos, como o dimetilssulfóxido, ou em soluções aquosas com boa resposta, mas sua eficiência ótima ocorre em meio básico (DIAS, 2001; ALMEIDA, 2009).
  9. 9. No mecanismo mais provável aventado para descrever a reação mais simples do luminol em meio aquoso, um metal de transição que age como catalisador realiza a conversão do luminol (1) em diazoquinona (2), de acordo com a figura 3. A diazoquinona é então atacada pelo ânion proveniente do peróxido de hidrogênio hidrolisado, formando um endoperóxido (3); este perde uma molécula de nitrogênio (N2) e forma então o diânion do ácido 3-aminoftálico (4), que já é produzido no estado excitado. Essa é a espécie que sofrerá decaimento, gerando a quimioluminescência por meio da emissão de luz em 431 nm quando o elétron excitado pela reação retorna ao seu estado fundamental (5) (DIAS, 2001; MARQUETTE; BLUM, 2006). Figura 3 – Mecanismo proposto para a oxidação do luminol por peróxido de hidrogênio catalisada por um metal de transição (M+n), em meio aquoso. Fonte: DIAS (2001). O luminol é eficaz para detectar sangue, mesmo depois de lavado diversas vezes (PONCE et al, 2002) devido ao fato de que, presente nas hemácias, está a hemoglobina que contém íons de ferro em seu grupo heme e agem como o catalisador necessário para desencadear a reação quimioluminescente do luminol (FERREIRA; ROSSI, 2002). Quando ainda se encontra dentro do organismo, a hemoglobina permanece protegida pelos eritrócitos que possuem mecanismos (enzimáticos e não enzimáticos) para evitar sua desnaturação, mantendo os íons ferro na forma Fe2+. Ao deixar o corpo, o sangue passa a estar exposto a uma série de processos degradativos, passando por hemólises e reações de
  10. 10. oxirredução catalisadas em um primeiro momento por enzimas de sua própria estrutura celular e, também, por aquelas presentes em microrganismos que se encontram no ambiente (BARNI et al, 2007). Sob tais condições, ocorre então a degradação da porção polipeptídica da hemoglobina, e a oxidação do íon ferroso (Fe2+) passa a acontecer de forma espontânea, com a conversão da hemoglobina a metahemoglobina e, em meio alcalino, este íon passa a coordenar-se com grupos hidroxila em substituição ao O2, que anteriormente ligava-se ao Fe2+ (ALMEIDA, 2009). Esse novo grupo prostético heme composto por íons férricos em que as moléculas de oxigênio estão sendo substituídas por hidroxilas é chamado hematina (ferroprotoporfirina) e o ciclo catalítico da reação luminol/sangue no mecanismo proposto por Maloney e Thornton em 1985 (ALMEIDA, 2009) é iniciado e finalizado por ele: ao borrifar o reagente sobre uma mancha de sangue, os grupamentos heme férricos (Fe3+) perdem mais um elétron e vão para um novo estado de oxidação, formando dessa forma intermediários instáveis contendo Fe4+, que então catalisam sua oxidação, produzindo assim a luminescência, enquanto são reduzidos novamente a Fe3+ (BARNI et al, 2007). Existem algumas outras proposições para descrever o mecanismo, no entanto esta ainda permanece como a mais aceita atualmente. Uma das maiores preocupações com relação à utilização dos testes de presunção é que os componentes aplicados sobre o material estudado danifiquem sua estrutura de alguma forma e prejudiquem análises laboratoriais, como a extração de DNA, que é de extrema importância para a atividade pericial. Com o intuito de verificar a ocorrência desse fato, alguns estudos foram realizados utilizando vários tipos de reagentes utilizados em testes presuntivos. Um desses experimentos foi publicado por Ponce e colaboradores em 2002, com a intenção de verificar uma possível interferência do luminol em posteriores extrações e amplificações de DNA. O experimento foi conduzido com tecidos brancos de algodão manchados de sangue seco a temperatura ambiente. Os tecidos foram lavados com detergente padrão em lavadora, a 30 oC e secos ao ar livre. Uma das amostras foi testada com luminol e outra foi armazenada para realizar as amplificações de DNA por PCR. O tecido testado com luminol foi lavado, seco e testado com o reagente novamente até que se obtivesse um resultado negativo para a luminescência, o que só ocorreu após a décima primeira lavagem. Após cada lavagem foi realizada a extração do DNA, cuja resposta foi ainda positiva até a terceira lavagem. Essa pesquisa indicou que não existem diferenças entre os resultados de amplificação de amostras sem o tratamento prévio com o luminol e
  11. 11. aquelas que foram testadas com o reagente (PONCE et al, 2002), o que demonstra que o luminol não interfere na análise de DNA por PCR. SENSIBILIDADE E LIMITAÇÕES A sensibilidade de técnicas quimioluminescentes como esta é bastante elevada, podendo chegar a limites de detecção na ordem de fentomol (10-15 mol) não são incomuns nas técnicas de quimioluminescência e em alguns sistemas enzimáticos já foram detectadas cerca de 120 moléculas, conforme esclarecem Ferreira; Rossi (2002). O luminol opera com limites de detecção muito pequenos, e é capaz de indicar a presença do analito, nesse caso, sangue, em concentrações extremamente pequenas. Existem estudos que apontam sua eficácia para a detecção de sangue em superfícies submetidas a até dez lavagens (PONCE et al, 2002) demonstrando, dessa forma, o alto grau de sensibilidade do teste, descrito na literatura como 1:5.000.000 em tecidos de algodão e 1:100.000 em superfícies que não sejam absorventes (ALMEIDA, 2009). Uma das limitações que o reagente apresenta é que, devido à sua labilidade, deve ser preparado no momento da utilização e deve ser mantido sob refrigeração para que suas propriedades sejam preservadas e a confiabilidade do teste mantida. Isso acarreta uma dificuldade em transportar o material até o local onde será empregado, por existir a necessidade da manipulação in loco, além de aumentar o custo para a sua utilização (ALMEIDA, 2009). A baixa especificidade também pode ser apontada como uma limitação do luminol, a ser considerada grave, uma vez que, pode induzir a resultados falso-positivos com íons metálicos como ferro, cromo ou cobalto, que catalisam a reação e desencadeiam a emissão de luz pelo reagente, além de peroxidases de vegetais e outros tipos de agentes oxidantes fortes que também reagem com o composto e geram a emissão de luz (CREAMER et al, 2003). Superfícies limpas com alvejantes igualmente podem apresentar alguma interferência, pois o hipoclorito presente na maior parte dos alvejantes domésticos também pode levar à produção de resultados positivos ilusórios. Contudo, pesquisas demonstraram
  12. 12. que a luminescência gerada pelo hipoclorito não possui o mesmo comprimento de onda (430 ± 3 nm) daquela gerada pelo grupo heme do sangue (455 ± 2 nm) e o tempo de duração da emissão de luz e sua forma de extinção não são compatíveis, uma vez que, a luminescência produzida pelo sangue decresce com o passar do tempo, enquanto aquela advinda do hipoclorito dissipa-se da superfície em que se encontra (CREAMER et al, 2003). É necessária muita atenção e experiência ao cientista forense para diferenciar essas emissões, que se tornam ainda mais semelhantes quando vistas em fotografia, o que é necessário ao procedimento de investigação. Dessa forma, existem estudos e técnicas adequadas para que essa interferência seja eliminada, diminuindo assim o risco de erro na análise devido a esse fator (KENT; ELLIOT; MISKELLY, 2003). Os alvejantes contêm estabilizantes voláteis em sua formulação, que acabam por evaporar com o passar do tempo; dessa forma, a quimioluminescência provocada pelo hipoclorito já não é mais um interferente após 8 h da aplicação do alvejante na superfície estudada (CEAMER et al, 2005), ou também é possível evitar tal interferência por meio da adição de aminas primárias e secundárias ao preparar o reagente, pois elas apresentam a propriedade de inibir a quimioluminescência oxidativa do luminol causada pelo hipoclorito. Deve-se, no entanto, ter atenção, pois já foi demonstrado que aminas terciárias causam o efeito inverso: aumentam a produção da luminescência e a via catalítica mais provável e aceita para a ocorrência deste fato é a formação de íons clorotrialquilamônio, que atuariam como oxidantes (KENT; ELLIOT; MISKELLY, 2003). A reação entre as aminas e o hipoclorito depende do pH do meio e da basicidade da amina, pois quanto mais básica ela for, mais competitiva será pelo hipoclorito frente ao luminol, não deixando que ele reaja com este último (KENT; ELLIOT; MISKELLY, 2003). A literatura descreve o preparo do reagente com 0,05 mol/L de glicina (C2H5NO2), que é apontada como uma boa amina para impedir a oxidação do luminol pelo hipoclorito (ALMEIDA, 2009). A exposição do resíduo hemático a fatores ambientais também influencia de maneira substancial no resultado dos testes de presunção. Vestígios submetidos a condições adversas, como enterrados ou submersos em água ou, simplesmente o decorrer do tempo, podem fazer com que esses testes já não apresentem a eficácia inicialmente esperada. É sabido que a efetividade do luminol para indicar a presença de sangue em vestígios dessa natureza ainda é alta, tornando-o o reagente mais indicado para testar amostras envelhecidas ou que se apresentem em mau estado de conservação (PITARCH et al, 2010).
  13. 13. Estudos recentes apontam sua capacidade de detectar traços de sangue depositado no solo após seis anos de exposição ao ar livre. Este experimento foi iniciado no ano de 2004, com os pesquisadores marcando um X com sangue no chão, deixado sob as condições locais e testado com luminol a cada dois meses para verificar o tempo de permanência de vestígios; e finalizado em 2010 quando ainda era possível perceber traços hemáticos no local com a aplicação do reagente (GABEL; SHIMAMOTO; STENE; ADAIR, 2011). Este resultado demonstra, mais uma vez, que os métodos quimioluminescentes de análise forense, dos quais o luminol é o principal, são extremamente eficazes para indicar a presença de sangue após um período longo, por apresentar sensibilidade bastante elevada, sendo capaz de reagir mesmo com quantidades ínfimas de analito, como no caso da referida pesquisa. CONSIDERAÇÕES FINAIS O luminol é um composto eficiente para detectar manchas de sangue frescas e latentes, e para este último tipo é tido como a melhor escolha, pois sua capacidade para localizar manchas envelhecidas e não visíveis a olho nu lhe confere vantagem frente às demais técnicas não quimioluminescentes. Possui alta sensibilidade e limite de detecção extremamente pequeno, mas sua especificidade é um ponto fraco: Pode reagir com outros compostos, como alguns metais e alvejantes domésticos, gerando resultados falsopositivos. A mecanística da reação, apesar de bastante estudada pela comunidade forense internacional, ainda não é completamente compreendida. Contudo, existem proposições bem aceitas para descrever o processo da reação genérica e da reação específica com o sangue. Os procedimentos de coleta e preservação dos vestígios encontrados em locais de crime devem ser rigorosamente seguidos para que a prova seja válida. O luminol é um reagente interessante para revelar manchas de sangue latentes em locais de crime de onde ainda seja necessário obter outras provas, por não interferir em posteriores análises de DNA. Nesse sentido, mesmo enfrentando algumas limitações e interferências, o luminol é um teste presuntivo para sangue bastante útil e eficaz como e um reagente de grande importância para a perícia em locais de crime.
  14. 14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS SANTOS, Roberto Márcio Souza; SANTOS, Maiza Ferreira; COSTA, Maria de Fátima Dias. Quimioluminescência e Bioluminescência. Disponível em: <http://quimicanova.sbq.org.br/qn/qnol/1993/vol16n3/v16_n3_%20(6).pdf>. Acesso em 14 fev. 2011. FERREIRA, Ernesto Correa; ROSSI, Adriana Vitorino. A quimiluminescência como ferramenta analítica: do mecanismo a aplicações da reação do luminol em métodos cinéticos de análise. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/qn/v25n6a/12777.pdf>. Acesso em 14 fev. 2011. SALGADO, Guillermo; NAVARRETE, José; BUSTOS, Carlos; SÁNCHEZ, Cristián; UGARTE, Ricardo. Quimioluminescencia electrogenerada del luminol usando electrodos de bajo costo. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/qn/v29n2/28461.pdf>. Acesso em: 21 fev. 2011. RODRIGUES, Cláudio Vilela; SILVA, Márcia Terra da; TRUZZI, Oswaldo Mário Serra. Perícia criminal: uma abordagem de serviços. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/gp/v17n4/a16v17n4.pdf>. Acesso em: 01 mar. 2011. CHEMELLO, Emiliano. Ciência forense: Manchas de sangue. Disponível em: <http://www.quimica.net/emiliano/artigos/2007jan_forense2.pdf>. Acesso em: 12 mar. 2011. BLUM, L. J.; ESPERANÇA, Philippe; ROCQUEFELTE, Stéphanie. A new highperformance reagent and procedure for latent bloodstain detection based on luminol chemiluminescence. Disponível em: < http://www.bluestarforensic.com/pdf/en/CSFS_vol39_bluestar_blum.pdf>. Acesso em: 21 mar. 2011. PONCE, Ana Castelló; PASCUAL, Fernando A. Verdú. Critical revision of presumptive tests for bloodstains. Disponível em: <http://projects.nfstc.org/workshops/resources/articles/Critical%20Revision%20of%20Presu mptive%20Tests%20for%20Bloodstains.pdf>. Acesso em 30 mar. 2011. PONCE, Ana Castelló; SEGUÍ, M. Álvarez; FEUCHT, M. Miquel; PASCUAL, Fernando A. Verdú. Revelado de manchas latentes: efectividad del luminol y evaluación de su efecto sobre el estudio del DNA. Disponível em: <http://scielo.isciii.es/pdf/cmf/n28/original2.pdf>. Acesso em 30 mar. 2011. PITARCH, Pascual Gil; PASCUAL, Fernando Verdú; PONCE, Ana Castelló; MUÑOZ, Maria del Carmen Negre. Técnicas de criminalística en manchas de sangre: factor ambiental en las pruebas de orientación. Disponível em: <http://revistas.ucm.es/med/18873278/articulos/REML1010220004A.PDF>. Acesso em: 30 mar. 2011.
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