次世代シーケンス解析サーバーReseq解析マニュアル

次世代シーケンス解析サーバー
Reseq解析GUIマニュアル

v. 3.0
Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved.

次世代シーケンス解析サーバーのご紹介

本サーバーは、次世代シーケンスデータ解析において一般的に
用いられている公開ソフトを中心に構成されています。
 複数サンプルを指定して自動的に解析
 解析結果をわかりやすくレポート
それでは、解析手順をご紹介します。

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サーバーの起動とログイン

サーバーの電源がOFFの時は、電源ボタンを押して起動して下さい。
※通常サーバーの電源は切らないようにしてください

上記ログイン画面が表示されたらユーザー名と
パスワードを入力してログインして下さい。

端末の起動

デスクトップ上でマウスを右クリックしてください。
メニューの「端末の中に開く」をクリックすると、端末が起動します。


解析の準備

ここでは、データ解析を/home/user/analysis で実行します。
以下のコマンドを打って、analysisディレクトリを作成します。

$ cd ← 自分のホームディレクトリへ移動
$ mkdir analysis ← 解析用のanalysisディレクトリを作成
$ cd analysis/ ← 作成したanalysisディレクトリへ移動

cp コマンドを用いて、解析したいFastqファイルを
analysisディレクトリにコピーします。
$ cp /home/share/example/reseq/SRR077861_*.fastq /home/user/analysis

※ディレクトリとはWindowsにおけるフォルダと同じ意味です。

解析の実行

tsvファイルを作成し、
端末内に以下のコマンドを入力し解析を実行します。

$ ls -l ← コピーができたかどうかの確認
$ python -u /usr/local/src/amelieff/reseq/reseq.py -s 1 -l SRR077861.tsv
-g hg19 -a > log 2>&1 & ← Reseq 解析プログラムの実行

 詳細は別紙「Reseq解析フロー」をご覧ください。
 -a オプションを外すとannoverをご利用になれます。
詳細は「マニュアル別紙 Annovar事前準備」をご覧ください。

実行状況の確認方法（１）
実行中のジョブの確認

端末内で、topコマンド
を入力すると実行中の
ジョブが確認できます。
$ top

右の例ではuser の bwa
ジョブが流れています。

このtop画面を終了するときは、qを押します。

実行状況の確認方法（２）
出力ファイル・ディレクトリの確認

デスクトップの
userのホーム →
analysis の順に
クリックします。

ディレクトリが５つ、
サマリーファイル
（SRR077861.log）が
１つできていること
を確認します。


実行状況の確認方法（３）
サマリーファイルの確認
得られたサマリーファイル（SRR077861.log）を
windowsパソコンにコピーし、Excelで開きます。

サマリーファイルには、5つの解析項目の開始・終了時間と
実行結果の情報が記載されています。
9

サマリーファイルの詳細

サマリーファイルのヘッダーには、解析の基本情報が書かれます。
###########################################
#RESEQ PIPELINE START: 2012/12/19-13:17:43 ①
# file = SRR077861.tsv ②
# genome = hg19 ③
# bed = /home/genome/hg19/ccds.bed ④

① 解析を始めた時間
② 解析の対象となるFastqファイルのリスト
③ 解析に使用するリファレンスゲノム
④ 集計を行うターゲット領域
（濃縮キットを使用した場合は販売元にお問い合わせください）

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サマリーファイルの詳細：Step1(QC結果)

## Step1:1_qc
Num Sample Start End Time(sec)
SRR077861 2012/12/19-13:17:43 2012/12/19-13:17:54 10

Info Result
[SRR077861_1.clean.fastq.gz]Pass_reads/Total_reads 8641/8707(99.24%) ①
[SRR077861_1.clean.fastq.gz]Pass_bases/Total_bases 765303/769187(99.50%) ②
[SRR077861_2.clean.fastq.gz]Pass_reads/Total_reads 8641/8707(99.24%)
[SRR077861_2.clean.fastq.gz]Pass_bases/Total_bases 766170/769287(99.59%)

① 全リードのうち、クオリティ・フィルタリングをパスしたリードの割合
② 全塩基のうち、クオリティ・フィルタリングをパスした塩基の割合

11

サマリーファイルの詳細：
Step２(Mapping結果)
## Step2-4:2_mapping,3_realignment,4_snv/indel,5_annotation
# sample = SRR077861
Step Process Start End Time(sec)
2 Mapping 2012/12/19-13:17:54 2012/12/19-13:18:08 13
Info Result
Mapped_reads/Pass_reads 16768/17282(97.03%) ①
After_duplicate_reads_removed 16691 ②
Target_num 25504 ③
Target_size 937613923 ④
No_covererd_target_num 25503,99.9% ⑤
① クオリティ・フィルタリングをパスしたリードのうち、マッピングされたリードの割合
② 重複リードを除外した後のリード数
③ 実行時に指定したターゲット領域に含まれる領域数
（未指定の場合はCCDSの領域数）
④ ターゲット領域の大きさ（未指定の場合はCCDSの大きさ）
⑤ リードが1本もマッピングされなかったターゲット領域の数と割合
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Step2～3(Mapping～Realignment結果)
Average_depth(x1) 21.7
(x10) 82.8
(x30) 118.7
①
(x50) 141.9
Coverage(x1) 0.00%
Coverage(x10) 0.00%
Coverage(x30) 0.00%
②
Coverage(x50) 0.00%

① カバレージ X 以上のターゲット領域上の平均カバレージ
② カバレージ X 以上でカバーされているターゲット領域の割合

3 Realignment 2012/12/19-13:18:08 2012/12/19-13:35:26 1038

Regions_local_realignment 76 ③

③ ローカルリアライメントを行った領域の数
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Step4～5(SNV/Indel～Annotate結果)
4 SNV/Indel 2012/12/19-13:35:26 2012/12/19-14:25:12 2985

5 Annotate 2012/12/19-14:25:12 2012/12/19-14:39:52 880
SNV 31 ①
Indel 2 ②
Filtered_SNV 17 ③
Filtered_Indel 2 ④
# All_Process_End ⑤
① 検出されたSNV数
② 検出されたInsertion/Deletion数
③ クオリティのフィルタリングをパスしたSNV数
④ クオリティのフィルタリングをパスしたInsertion/Deletion数
⑤ １つのサンプルの解析が全て終了
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QC結果確認

Fastqファイル毎にQCの
レポートが出力されます。

analysisディレクトリの
1_qc → tmp →
SRR077861_1_QCleaner →
SRR077861_1.clean_fastqc →
fastqc_report.html
の順にクリックします。


QC結果確認

ウェブブラウザでFastQCの結果を確認できます。

SNV/Indel検出結果の確認

analysisディレクトリの
5_annotation →
SRR077861_small_snpEff_
summary.html
の順にクリックします。


SNV/Indel検出結果の確認

ウェブブラウザでSNV/Indelの集計結果を確認できます。

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