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Práctica 13 – VIH                                                                 Página |1

PRACTICA 13
El virus de la Inmunodeficiencia humana – VIH

Dr. David Larreátegui R.
Docente de Cátedra – Médico Especialista en Medicina Interna.

13.1. INTRODUCCION E HISTORIA

13.2. ORIGEN Y ESTRUCTURA DEL VIH

13.3. HISTORIA NATURAL DEL VIH

13.4. DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCION POR VIH-1
13.4.1. PRUEBAS SEROLÓGICAS
13.4.2. PRUEBAS DE SCREENING
13.4.3. PRUEBAS DE DETECCIÓN RAPIDA.
13.4.4. PRUEBAS DE CONFIRMACION

13.6. ALGORRITMO DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR VIH

13.7. INMUNOCROMATOGRAFIA – PRUEBA RAPIDA – PRACTICA.
13.8. MICROELISA – PRUEBA DE SCREENING – PRACTICA.}
13.9. AUTOEVALUACION E INVESTIGACION




INTRODUCCION E HISTORIA
El VIH es el agente etiológico causal del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Esta
enfermedad se describió por primera vez en 1981, en varones jóvenes homosexuales que
padecían Sarcoma de Kaposi y/o neumonía por Pneumociostis Jiroveci. El estudio de estos
pacientes reveló que presentaban un cuadro inmunológico caracterizado por la disminución de
linfocitos TCD4+. Los estudios epidemiológicos posteriores implicaron en la enfermedad a un
agente infeccioso transmisible por sangre, por productos sanguíneos, contactos sexuales, uso de
drogas de vía endovenosa y verticalmente de madre a hijos. La búsqueda de este agente
infeccioso tuvo sus frutos en 1983 cuando Barre-Sinousi, Chairman y Luc Montagnier del Instituto
Pasteur de París aislaron un retrovirus a partir de nódulos linfáticos de un paciente con
linfadenopatías, este retrovirus fue denominado virus de la Linfadenopatía (VLA) y era capaz de
replicarse y causar efectos citopáticos en células mononucleares en sangre periférica. 1

                                    2           3
Pocos meses después Gallo y cols, y Levy y cols , aislaron un retrovirus a partir de muestras con
Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) al que denominaron VLTH-III, finalmente se
decidió denominar al virus como virus de la Inmunodeficiencia humana – VIH, 2 años más tarde
fue aislado un segundo tipo de virus VIH-2 que producía SIDA en paciente provenientes de África
Occidental 4. Actualmente se denomina VIH-1 a los virus genéticamente relacionados por los virus
que cursan en Asia, América, Europa y ciertas partes de África. Mientras que se denomina VIH-2 al
conjunto de virus relacionado con el virus descrito que es prevalente en África Central y
Occidente. Desde su identificación hasta la actualidad el VIH se ha convertido posiblemente en
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uno de los agentes infecciosos que más rápidamente se ha estudiado y que más trabajo ha
generado en la historia de la Biomedicina y la Microbiología.
En pocos años la infección por el VIH-1 se convirtió en una Pandemia y en la causa más frecuente
de mortalidad al menos en el segmento etario entre los 20-40 años 7. Ya en 1984 cuando pudo
disponerse de tests diagnósticos para detectar la presencia de infecciones (Detección de
anticuerpos), se estableció claramente que el VIH-1 era el agente causante del SIDA (7) y que se
trataba de una enfermedad de evolución lenta (Promedio de 7 a 10 años), antes de desembocar
en una inmunodeficiencia severa y global (Aunque de predominio de la inmunidad celular), que se
complicaba con infecciones o neoplasias “Oportunistas”, que solía conducir a un desenlace
                                                                         9
uniformemente fatal en menos de 1 a 2 años a partir de aquel momento. .
También desde el primer momento llamó la atención la paradoja de que una inmunodeficiencia
progresiva coexistía con una hiperactivación crónica del sistema inmunitario y que ahora sabemos
                                                                       10,11.
que es el mejor marcador para predecir la progresión de la enfermedad

ORIGEN Y ESTRUCTURA DEL VIH
Los retrovirus constituyen una familia compleja de un virus ARN en la cual se distinguen 7 géneros
uno de estos géneros es el de los Lentivirus en el que se encuadraría el VIH y donde su principal
característica es la infección crónica a una gran variedad de especies de mamíferos entre los que
se encuentran los primates, ungulados y felinos. A los lentivirus procedentes de primates No-
Humanos se les ha dado un nombre genérico de Virus de la Inmunodeficiencia del Simio VIS,
debido a las similitudes genéticas y estructurales que estos comparten con los de la
Inmunodeficiencia Humana, los VIS presentan una gran diversidad y hasta la fecha se han podido
aislar en cerca de 40 especies distintas se han establecido depende de las especies y sub-especies
de los tipos de primates a los cuales infectaban.

El VIH se caracteriza también por presentar una elevada diversidad genética esta diversidad que
reflejada en los análisis filogénicos de la secuencia nucleotídicas que se han realizado con
numerosos virus aislados de diferentes procedencias geográficas. Estos análisis han llevado a
clasificar al VIH en cuatro grandes grupos (M,N,O,P) y al VIH-2 en 8 (A,B,C,D,E,F,G)

Las diferencias entre los 2 virus son mayor o igual al 40% 5. Dentro de cada uno de ellos hay varios
grupos con diferencias de mayor o igual al 30%. Los cuatro grupos del VIH-1 se denominan
M,N,O,P 5, y dentro del M responsable de la mayoría de infecciones se distinguen subtipos y
formas recombinantes con diferencias entre mayor y menor grado entre el 15 y 20 % de países del
sub-tipo B este es el serotipo inmunitario mayormente patógeno a nivel global y mundial. Seguido
por el serotipo C que es el más fácilmente transmisible por las vías sexuales. 6.

El virión del virus de la Inmunodeficiencia humana es aproximadamente esférico y mide entre 80 y
120 nm de diámetro, está compuesto por 2 copias de ARN de cadena positiva única con un
tamaño de 749 pares de bases y que codifican para los genes del virus. Las cadenas de ARN están
rodeadas por una cápside cónica compuesta por 1.200 a 2.500 copias de la proteína viral p24 13.

La cadena única de ARN se encuentra fuertemente asociada a las proteínas de la nucleocápside p6
y p7 y a las enzimas necesarias para el desarrollo del Virion: Transcripatasa Reversa, Proteasa,
Nucleasa e Integrasa. La nucleocápside se asocia con el ARN genómico protegiéndolo de la
digestión de las Nucleasas. La cápside está rodeada por una matriz compuesta de una asociación
de la proteína viral p17 que garantiza la integridad de la partícula viral. La cápsida está rodeada
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por una envoltura que está formada por una Bicapa-Lipídica con origen de la célula huésped, y se
produce por la gemación y exocitosis de la cápside viral. Las proteínas de la envoltura viral se
organizan en espículas que son estructuras formadas por 3 glicoproteínas de superficie gp-120 y 3
glicoproteínas transmembrana (gp-41) que sujetan la estructura al virus, se estima que el número
                                                    12,14,15
de espículas por virión es de aproximadamente                . Estas estimaciones se han visto
confirmadas por estudios posteriores de crio-microscopía 16. La representación esquemática de la
partícula se muestra en la Figura 1.




                                   Fig-1 Estructura del VIH
                        (Tomado de Motangier y cols – Instituto Pasteur).

Hasta el 2006, la información estructural sobre la espícula y las características genéticas eran
limitada y provenía en gran parte de análisis de estudios cristalográficos sin embargo
posteriormente se pudo aclarar esta temática. Demostrando que el ARN genómico se cpompne de
7 elementos estructurales y nueve genes que codifican para 19 proteínas en total. Tres de estos
genes (Gag, Env, Pol) codifican las principales proteínas estructurales que se encuentran en todos
los retrovirus, mientras los 6 restantes genes no estructurales codifican las proteínas reguladoras
de los procesos metabólicos del virus. Estos son genes únicos del VIH que controlan la capacidad
para infectar las células, producir nuevas copias de virus o inducir patogénesis.

HISTORIA NATURAL DEL VIH
La infección por el VIH es un ejemplo único de infección viral persistente que causa replicación
viral y enfermedades crónicas en el 100% de los casos. La persistencia a nivel molecular se explica
por diferentes mecanismos y la capacidad del virus para evadir de forma continua el sistema
                                       12
inmunológico es también multifactorial . El paradigma clásico es una primoinfección o infección
aguda sintomática o asintomática seguido por un largo período promedio entre 7 a 10 años
clínicamente silente o solo con complicaciones menores que a menudo no se identifican
relacionadas con el VIH. Hasta que aparecen algunas de las infecciones o neoplasias
“Oportunistas” aceptadas como definitorias de SIDA.
Durante la infección aguda, la concentración del virus infeccioso circulante es muy elevada para
que en pocas semanas o meses, alcanzar una situación de equilibrio que suele oscilar entre las
10.000 y 200.000 copias de ARN del VIH-1/ml de plasma. (Carga Viral). La cifra de linfocitos TCD4+
circulantes que normalmente oscila entre 600 y 1200 células/ul suele experimentar un descenso
moderado durante la infección aguda y luego más paulatino (promedio de 50 células/año). (Fig 2).
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                                  Fig-2 HISTORIA NATURAL DEL VIH
                   (Tomado de Jurema Oliveira – Instituto Infectológico de Brasil).
Los eventos Oportunistas suelen aparecer con excepciones cuando la cifra de linfocitos cae por
debajo de 200 células/ul y sobre todo cuando cae por debajo de 100celulas/ul. El nuevo
paradigma podría ser considerar a la infección por el VIH-1 como la historia de 2 infecciones en un
mismo proceso, la primera como Infección aguda, que condiciona una depleción muy rápida,
masiva y difícilmente reversible en los linfocitos TCD4+ memoria/efectores de las mucosas en
general y de la mucosa intestinal en particular (GALT). Principalmente por un mecanismo citolítico
directo del virus. Y la segunda o infección crónica es la historia de un sistema inmunitario “Herido”
que a pesar de conservar unas reservas prácticamente intactas va “muriendo lentamente” no
exclusivamente por las heridas de las infecciones aguda, ni en gran medida, por mecanismos
directamente relacionados con la infección viral 14. Haciendo que muchos gérmenes patógenos
controlados inicialmente por el sistema inmune se activen y causen enfermedad (Germen
patógeno), uno de estos ejemplos clásicos es la tuberculosis y la toxoplasmosis.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCION POR VIH-1
El diagnóstico de la infección por el VIH solo puede establecerse de modo definitivo por medios de
laboratorio ya que las manifestaciones clínicas son inespecíficas en cualquier estadío de la
enfermedad. Las pruebas de laboratorio utilizadas para reconocer las infecciones por retrovirus
humanos pueden clasificarse en directas e indirectas (Figura 3). Según persigan demostrar la
presencia del virus o de sus constituyentes (Proteínas y Ácidos nucleicos) o bien la respuesta
inmunitaria (Humoral o celular) por parte del huésped.

FIGURA 3 Clasificación de los métodos de laboratorio para diagnóstico de infección por VIH.
Métodos Directos
      Cultivo Viral
      Detección de Ácidos Nucleicos: PCR, bDNA, NASBA.
      Antigenemia (p24).
Métodos IndirectosDetección de anticuerpos específicos.
               Pruebas Rápidas: Oral test.
               Pruebas de Screening: ELISA, Aglutinación, Inmunocromatografía.
               Pruebas de Confirmación y Suplementarias: WB,IFI.
      Investigación de inmunidad celular específica.
        Notas: bDNA (branched-DNA), ELISA (Enzimoinmunoanálisis), IFI (Inmunofluorescencia indirecta), WB (Western Blood),
        NASBA (Amplificación en la transcripción de ácidos nucleicos), PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa).
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PRUEBAS SEROLÓGICAS
La investigación de anticuerpos en suero es la metodología más frecuentemente utilizada para la
identificación de los individuos de VIH. La presencia de anticuerpos anti-VIH lejos de reflejar una
exposición erradicación inmune del virus en el pasado, indica más bien el estado de portador
actual.
Existen diferentes tipos de pruebas para la detección de anticuerpos frente al VIH. El diseño de
algunas de ellas permite realizar gran número de análisis a la vez son las denominadas pruebas de
Screening. En cambio, otras son de realización más compleja aunque proporcionan mayor
especificidad se utilizan para la confirmación de la reactividad en una prueba inicial de Screening.
La seropositividad define mediante la demostración de anticuerpos frente a las proteínas virales
con reactividad repetida en las pruebas de Screening y además, con algunas de las pruebas de
confirmación 1.

PRUEBAS DE SCREENING
El enzimoinmunoanálisis (ELISA) es el método más utilizado como prueba de Screening los
antígenos provienen del lisado viral de un cultivo (ELISA de primera generación) o bien
corresponden a proteínas recombinadas (ELISA de segunda generación), que reproducen epitopos
de virus, los EIA de segunda generación son más sensibles y , sobre todo, más específicos que los
de segunda generación. Además, las pruebas de ELISA pueden estar diseñadas de modo indirecto
o competitivo según el mecanismo por el que se reconoce la precisión de anticuerpos en la
muestra problema. En general los ELISA indirectos son más sensibles y los ELISA competitivos son
más específicos.
En los últimos años se han desarrollado nuevas técnicas de ELISA que son más sensibles y
específicas que las ELISA iniciales. Utilizan como antígenos especiales, proteínas recombinantes o
péptidos sintéticos de 10 a 40 aminoácidos específicos del VIH-1 (en ocasiones, en asociación con
otros del VIH-2). Las dos técnicas son ELISA de tipo sándwich (Tercera generación) y ELISA de
captura (Cuarta generación). Estas pueden detectar todas las subclases de anticuerpos y no solo la
IgG. Esto explica su mayor sensibilidad para reconocer la primoinfección por VIH-1, cuando la IgM
es el primer marcador de la seroconversión, así como para el diagnóstico de la infección
pediátrica, que cursa con IgM e IgA solo si el niño está infectado. Además del ELISA de captura es
un método de gran especificidad. Permitiendo la detección simultánea de antígeno y anticuerpos,
con una media de 8 días antes que los de tercera generación.
En la actualidad existen más de 130 pruebas comerciales para la detección de anticuerpos frente
al VIH-1 en suero. En general las pruebas aprobadas para los bancos de sangre gozan de excelente
sensibilidad superior al 99,5%.

PRUEBAS DE DETECCIÓN RAPIDA.
Existen diversos métodos para la detección rápida de anticuerpos frente al VIH. Las pruebas de
inmunoadherencia (dot-blot) son más frecuentes aunque también se han desarrollado ensayos de
aglutinación. 2. En general todas ellas gozan de buena sensibilidad, especificidad y
fundamentalmente acortan ventajas en aquellos lugares en donde los test diagnósticos habituales
son de difícil incorporación. La gran mayoría tienen la capacidad de detectar las distintas variantes
de VIH-1 y VIH-2, por lo que su uso en África y Sud-América cada vez es más extendido,
especialmente para diagnósticos urgentes.
La FDA aprobó hace pocos años la utilización de ensayos OralQuick con saliva para su distribución
de venta libre en farmacias, este ensayo aporta la ventaja de que únicamente requiera la muestra
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 de la saliva para su uso, sin embargo no se pude olvidar que un diagnóstico positivo tiene que ser
confirmado por ELISAs especializados.

PRUEBAS DE CONFIRMACION
El Western-Blood (WB) es el método más empleado para la confirmación de resultados obtenidos
con las pruebas de Screening. Permite discriminar frente a qué antígenos virales se dirigen los
anticuerpos presentes en la muestra problema, Otras metodologías de confirmación como la
Inmunofluorescencia indirecta (IFI) presenta gran complejidad y gran subjetividad, lo que dificulta
su utilización sistemática como pruebas de confirmación 1.
En 1990 la OMS redacta la nomenclatura vigente de las bandas de proteínas del western blood y
estableció los siguientes criterios para su interpretación: la positividad en el WB para VIH-1
requiere la presencia de al menos 2 bandas de la envoltura; la negatividad resulta de la ausencia
de bandas y los restantes patrones se consideran indeterminados. (Fig. 5).

FIGURA 5. Causas de Wester Blood Indeterminado para VIH-1.

        Infección por VIH-2
        Seroconversión para el VIH-1.
        Pacientes en estadíos muy avanzados de la enfermedad.
        Niños de madres seropositivas.
        Reactividad inespecífica.

ALGORRITMOS DIAGNÓSTICOS PROPUESTOS PARA LA INFECCIÓN POR VIH
Una prueba de ELISA reactiva en una ocasión para anticuerpos frente al VIH-1 debe ser repetida en
la misma muestra antes de ser valorada como tal. Todas las muestras de ELISA repetidamente
reactivas deben ser confirmadas con WB. Diversos estudios han demostrado que la sensibilidad y
la especificidad del ELISA comercialmente son superiores al 98%, si bien, el número de falsos
positivos en un grupo de bajo riesgo de infección (como los donantes) quizá no sea insignificante.
Estos falsos positivos se han descrito en especial en individuos con enfermedades autoinmunes y
en pacientes con historias de múltiples gestaciones o transfusiones, relacionados con la existencia
de anticuerpos frente a algunos antígenos HLA de clase II. La utilización de pruebas de ELISA
diseñados con antígenos recombinantes o péptidos sintéticos ha reducido de manera considerable
las reacciones cruzadas y prácticamente en la actualidad una prueba de ELISA positivo es
diagnóstico de infección por VIH.

En la Figura 6. Se recoge el algoritmo diagnóstico recomendado para el diagnóstico de la infección
por el VIH, es necesario tener en cuenta el tipo de población estudiada, ya sea donantes de sangre
o población de bajo recurso ya que se han descrito falsos positivos en el WB. Aunque dicha
metodología es la más generalizada para la confirmación de la reactividad inicial en una prueba de
Screening puede considerarse otro tipo de estrategias diagnósticas como la confirmación
mediante LIA, en casos con resultados indeterminados.

En la Figura 7. El diagnóstico de la infección aguda por el VIH ha adquirido una especial relevancia
según se ha ido avanzando en el conocimiento de la enfermedad. El conocer por un lado las
características virológicas de las cepas (fundamentalmente la presencia de mutaciones de
resistencia y el subtipo viral) que son responsables de las nuevas infecciones y por otro lado las
ventajas que representa la instauración de terapia antiretroviral en este período ha hecho que se
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adopten nuevas estrategias diferentes a fin de diagnosticar estas infecciones. Estas incluyen
además de la realización de viremia plasmática para los casos previos a la seroconversión la
utilización de test de ELISA especiales y estándar para el diagnóstico de la enfermedad ante un
accidente laboral o un contacto sexual de riesgo.

                FIGURA 7. ALGORITMO DIAGNOSTICO DEL VIH EN LABORATORIO.




DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
PRUEBAS DE SCREENING
ELISA INDIRECTO.

Consta de las siguientes etapas:
   1. Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de
       estudio.
   2. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
   3. Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán
       específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos
       marcados que no hayan reaccionado.
   4. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los
       anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los
       antígenos.
   5. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
   6. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede
       parar la reacción si se desea.
   7. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

ELISA es una prueba de alta sensibilidad (99,5%), por lo que ante la mínima presencia de
anticuerpos del virus de VIH, e incluso de elementos similares, arrojará un resultado positivo. Esta
misma sensibilidad puede dar como resultado "falsos positivos" ante otros virus similares. Si la
prueba de ELISA sale negativa, no se hacen más pruebas, especificidad (99.2%). Valor predictivo
positivo (98.3%) y valor predictivo negativo (99.4%).
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       AUTOEVALUACION E INVESTIGACION

  1.   Que prueba realizaría para identificar a pacientes con VIH en una población amplia de riesgo?
       Inmunocromatogrfia HIV 1 y HIV2.
       Micro Elisa VIH 1 y 2
       Western Blood.
       Carga Viral
       Microelisa Rápido VIH1 y VIH2.

  2.   Enumere los 3 genes estructurales más importantes del VIH.

  3.   Enumere al menos 10 enfermedades, comorbilidades o signos clinicos que frecuentemente se
       encuentran asociadas a los pacientes portadores de VIH antes de la fase de SIDA?

  4.   Qué criterios debe reunir un paciente para iniciar TARV (Terapia Anti-retro Viral).

  5.   Enumere al menos 10 enfermedades que frecuentemente se encuentran asociadas a los pacientes
       con SIDA?

                         PROCEDIMIENTO PARA HIV1/2 ELISA

                                                Etapa 1

              Añadir al MIC, 60ul del control WCON: Solución de trabajo
                          de conjugado en las celdas a usar



             Añadir 30ul del control NEGATIVO-NC, POSITIVO- PC y 30ul
              de muestra en cada celda de reacción, excepto en el blanco



             Mezclar cuidadosamente(solución cambia de color),cubrir MIC
              con cintas adhesivas. Incubar el plato a 37+/- 1ºC, por 90’



                                                    Lavar el plato Ciclo
                                                    de 8 veces. Solución
                                                    Wash 350ul



                                                Etapa 2

                         Añadir 50ul de Sustrato              Añadir 50ul de Sustrato
                          de Solución A en cada                de Solución B en cada
                                 celdilla                             celdilla
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                                  Cubrir MIC con cintas adhesivas. Incubar
                                  el plato por 30 minutos de 18 a 25ºC en la
                                                  obscuridad




                                    Añadir 100ul de STOP (2N H2SO4) en
                                           cada celdilla. Mezclar
                                             cuidadosamente




                                     Determinar la Absorbancia a 450nm, y
                                        usando una longitud de onda de
                                             referencia de 620nm.




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programmatic issues. AIDS 2010;24:Suppl 4:S61-S69

7. Emau P, Jiang Y, Agy MB, Tian B, Bekele G, Tsai CC. Post-exposure prophylaxis for SIV revisited: animal
model for HIV prevention. AIDS Res Ther 2006;3:29-29.

8. Keele BF, Giorgi EE, Salazar-Gonzalez JF, et al. Identification and characterization of transmitted and early
founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Práctica 13 – VIH                                                                               P á g i n a | 10

9. Lee HY, Giorgi EE, Keele BF, et al. Modeling sequence evolution in acute HIV-1 infection. J Theor
Biol 2009;261:341-360.

10. Palmer S, Wiegand AP, Maldarelli F, et al. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with
single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J Clin Microbiol 2003;41.

11. Damond F, Avettand-Fenoel V, Collin G, et al. Evaluation of an upgraded version of the Roche Cobas
AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1 test for HIV-1 load quantification. J Clin Microbiol 2010;48:1413-1416.

12. Sickinger E, Jonas G, Yem AW, et al. Performance evaluation of the new fully automated human
immunodeficiency virus antigen-antibody combination assay designed for blood
screening. Transfusion 2008;48:584-593.

13. Haase AT. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature2010;464:217-223.

14. Hladik F, Sakchalathorn P, Ballweber L, et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by
human immunodeficiency virus type-1. Immunity 2007;26:257-270.

15. Boggiano C, Littman DR. HIV's vagina travelogue. Immunity 2007;26:145-147.

16. Zhang Z, Schuler T, Zupancic M, et al. Sexual transmission and propagation of SIV and HIV in resting and
activated CD4+ T cells. Science 1999;286:1353-1357[Erratum, Science 1999;286:2273.]

17. Zhang ZQ, Wietgrefe SW, Li Q, et al. Roles of substrate availability and infection of resting and activated
CD4+ T cells in transmission and acute simian immunodeficiency virus infection. Proc Natl Acad Sci.

18. Li Q, Duan L, Estes JD, et al. Peak SIV replication in resting memory CD4+ T cells depletes gut lamina
propria CD4+ T cells. Nature 2005;434:1148-1152.
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Práctica 13 – VIH                                        P á g i n a | 11




                       Universidad Central del Ecuador
                        Facultad de Ciencias Médicas
                            Escuela de medicina

              PRE-REQUISITOS DE MICROBIOLOGIA
NOMBRE:              DOCENTE:

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  • 1. LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Práctica 13 – VIH Página |1 PRACTICA 13 El virus de la Inmunodeficiencia humana – VIH Dr. David Larreátegui R. Docente de Cátedra – Médico Especialista en Medicina Interna. 13.1. INTRODUCCION E HISTORIA 13.2. ORIGEN Y ESTRUCTURA DEL VIH 13.3. HISTORIA NATURAL DEL VIH 13.4. DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCION POR VIH-1 13.4.1. PRUEBAS SEROLÓGICAS 13.4.2. PRUEBAS DE SCREENING 13.4.3. PRUEBAS DE DETECCIÓN RAPIDA. 13.4.4. PRUEBAS DE CONFIRMACION 13.6. ALGORRITMO DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR VIH 13.7. INMUNOCROMATOGRAFIA – PRUEBA RAPIDA – PRACTICA. 13.8. MICROELISA – PRUEBA DE SCREENING – PRACTICA.} 13.9. AUTOEVALUACION E INVESTIGACION INTRODUCCION E HISTORIA El VIH es el agente etiológico causal del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Esta enfermedad se describió por primera vez en 1981, en varones jóvenes homosexuales que padecían Sarcoma de Kaposi y/o neumonía por Pneumociostis Jiroveci. El estudio de estos pacientes reveló que presentaban un cuadro inmunológico caracterizado por la disminución de linfocitos TCD4+. Los estudios epidemiológicos posteriores implicaron en la enfermedad a un agente infeccioso transmisible por sangre, por productos sanguíneos, contactos sexuales, uso de drogas de vía endovenosa y verticalmente de madre a hijos. La búsqueda de este agente infeccioso tuvo sus frutos en 1983 cuando Barre-Sinousi, Chairman y Luc Montagnier del Instituto Pasteur de París aislaron un retrovirus a partir de nódulos linfáticos de un paciente con linfadenopatías, este retrovirus fue denominado virus de la Linfadenopatía (VLA) y era capaz de replicarse y causar efectos citopáticos en células mononucleares en sangre periférica. 1 2 3 Pocos meses después Gallo y cols, y Levy y cols , aislaron un retrovirus a partir de muestras con Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) al que denominaron VLTH-III, finalmente se decidió denominar al virus como virus de la Inmunodeficiencia humana – VIH, 2 años más tarde fue aislado un segundo tipo de virus VIH-2 que producía SIDA en paciente provenientes de África Occidental 4. Actualmente se denomina VIH-1 a los virus genéticamente relacionados por los virus que cursan en Asia, América, Europa y ciertas partes de África. Mientras que se denomina VIH-2 al conjunto de virus relacionado con el virus descrito que es prevalente en África Central y Occidente. Desde su identificación hasta la actualidad el VIH se ha convertido posiblemente en
  • 2. LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Práctica 13 – VIH Página |2 uno de los agentes infecciosos que más rápidamente se ha estudiado y que más trabajo ha generado en la historia de la Biomedicina y la Microbiología. En pocos años la infección por el VIH-1 se convirtió en una Pandemia y en la causa más frecuente de mortalidad al menos en el segmento etario entre los 20-40 años 7. Ya en 1984 cuando pudo disponerse de tests diagnósticos para detectar la presencia de infecciones (Detección de anticuerpos), se estableció claramente que el VIH-1 era el agente causante del SIDA (7) y que se trataba de una enfermedad de evolución lenta (Promedio de 7 a 10 años), antes de desembocar en una inmunodeficiencia severa y global (Aunque de predominio de la inmunidad celular), que se complicaba con infecciones o neoplasias “Oportunistas”, que solía conducir a un desenlace 9 uniformemente fatal en menos de 1 a 2 años a partir de aquel momento. . También desde el primer momento llamó la atención la paradoja de que una inmunodeficiencia progresiva coexistía con una hiperactivación crónica del sistema inmunitario y que ahora sabemos 10,11. que es el mejor marcador para predecir la progresión de la enfermedad ORIGEN Y ESTRUCTURA DEL VIH Los retrovirus constituyen una familia compleja de un virus ARN en la cual se distinguen 7 géneros uno de estos géneros es el de los Lentivirus en el que se encuadraría el VIH y donde su principal característica es la infección crónica a una gran variedad de especies de mamíferos entre los que se encuentran los primates, ungulados y felinos. A los lentivirus procedentes de primates No- Humanos se les ha dado un nombre genérico de Virus de la Inmunodeficiencia del Simio VIS, debido a las similitudes genéticas y estructurales que estos comparten con los de la Inmunodeficiencia Humana, los VIS presentan una gran diversidad y hasta la fecha se han podido aislar en cerca de 40 especies distintas se han establecido depende de las especies y sub-especies de los tipos de primates a los cuales infectaban. El VIH se caracteriza también por presentar una elevada diversidad genética esta diversidad que reflejada en los análisis filogénicos de la secuencia nucleotídicas que se han realizado con numerosos virus aislados de diferentes procedencias geográficas. Estos análisis han llevado a clasificar al VIH en cuatro grandes grupos (M,N,O,P) y al VIH-2 en 8 (A,B,C,D,E,F,G) Las diferencias entre los 2 virus son mayor o igual al 40% 5. Dentro de cada uno de ellos hay varios grupos con diferencias de mayor o igual al 30%. Los cuatro grupos del VIH-1 se denominan M,N,O,P 5, y dentro del M responsable de la mayoría de infecciones se distinguen subtipos y formas recombinantes con diferencias entre mayor y menor grado entre el 15 y 20 % de países del sub-tipo B este es el serotipo inmunitario mayormente patógeno a nivel global y mundial. Seguido por el serotipo C que es el más fácilmente transmisible por las vías sexuales. 6. El virión del virus de la Inmunodeficiencia humana es aproximadamente esférico y mide entre 80 y 120 nm de diámetro, está compuesto por 2 copias de ARN de cadena positiva única con un tamaño de 749 pares de bases y que codifican para los genes del virus. Las cadenas de ARN están rodeadas por una cápside cónica compuesta por 1.200 a 2.500 copias de la proteína viral p24 13. La cadena única de ARN se encuentra fuertemente asociada a las proteínas de la nucleocápside p6 y p7 y a las enzimas necesarias para el desarrollo del Virion: Transcripatasa Reversa, Proteasa, Nucleasa e Integrasa. La nucleocápside se asocia con el ARN genómico protegiéndolo de la digestión de las Nucleasas. La cápside está rodeada por una matriz compuesta de una asociación de la proteína viral p17 que garantiza la integridad de la partícula viral. La cápsida está rodeada
  • 3. LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Práctica 13 – VIH Página |3 por una envoltura que está formada por una Bicapa-Lipídica con origen de la célula huésped, y se produce por la gemación y exocitosis de la cápside viral. Las proteínas de la envoltura viral se organizan en espículas que son estructuras formadas por 3 glicoproteínas de superficie gp-120 y 3 glicoproteínas transmembrana (gp-41) que sujetan la estructura al virus, se estima que el número 12,14,15 de espículas por virión es de aproximadamente . Estas estimaciones se han visto confirmadas por estudios posteriores de crio-microscopía 16. La representación esquemática de la partícula se muestra en la Figura 1. Fig-1 Estructura del VIH (Tomado de Motangier y cols – Instituto Pasteur). Hasta el 2006, la información estructural sobre la espícula y las características genéticas eran limitada y provenía en gran parte de análisis de estudios cristalográficos sin embargo posteriormente se pudo aclarar esta temática. Demostrando que el ARN genómico se cpompne de 7 elementos estructurales y nueve genes que codifican para 19 proteínas en total. Tres de estos genes (Gag, Env, Pol) codifican las principales proteínas estructurales que se encuentran en todos los retrovirus, mientras los 6 restantes genes no estructurales codifican las proteínas reguladoras de los procesos metabólicos del virus. Estos son genes únicos del VIH que controlan la capacidad para infectar las células, producir nuevas copias de virus o inducir patogénesis. HISTORIA NATURAL DEL VIH La infección por el VIH es un ejemplo único de infección viral persistente que causa replicación viral y enfermedades crónicas en el 100% de los casos. La persistencia a nivel molecular se explica por diferentes mecanismos y la capacidad del virus para evadir de forma continua el sistema 12 inmunológico es también multifactorial . El paradigma clásico es una primoinfección o infección aguda sintomática o asintomática seguido por un largo período promedio entre 7 a 10 años clínicamente silente o solo con complicaciones menores que a menudo no se identifican relacionadas con el VIH. Hasta que aparecen algunas de las infecciones o neoplasias “Oportunistas” aceptadas como definitorias de SIDA. Durante la infección aguda, la concentración del virus infeccioso circulante es muy elevada para que en pocas semanas o meses, alcanzar una situación de equilibrio que suele oscilar entre las 10.000 y 200.000 copias de ARN del VIH-1/ml de plasma. (Carga Viral). La cifra de linfocitos TCD4+ circulantes que normalmente oscila entre 600 y 1200 células/ul suele experimentar un descenso moderado durante la infección aguda y luego más paulatino (promedio de 50 células/año). (Fig 2).
  • 4. LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Práctica 13 – VIH Página |4 Fig-2 HISTORIA NATURAL DEL VIH (Tomado de Jurema Oliveira – Instituto Infectológico de Brasil). Los eventos Oportunistas suelen aparecer con excepciones cuando la cifra de linfocitos cae por debajo de 200 células/ul y sobre todo cuando cae por debajo de 100celulas/ul. El nuevo paradigma podría ser considerar a la infección por el VIH-1 como la historia de 2 infecciones en un mismo proceso, la primera como Infección aguda, que condiciona una depleción muy rápida, masiva y difícilmente reversible en los linfocitos TCD4+ memoria/efectores de las mucosas en general y de la mucosa intestinal en particular (GALT). Principalmente por un mecanismo citolítico directo del virus. Y la segunda o infección crónica es la historia de un sistema inmunitario “Herido” que a pesar de conservar unas reservas prácticamente intactas va “muriendo lentamente” no exclusivamente por las heridas de las infecciones aguda, ni en gran medida, por mecanismos directamente relacionados con la infección viral 14. Haciendo que muchos gérmenes patógenos controlados inicialmente por el sistema inmune se activen y causen enfermedad (Germen patógeno), uno de estos ejemplos clásicos es la tuberculosis y la toxoplasmosis. DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCION POR VIH-1 El diagnóstico de la infección por el VIH solo puede establecerse de modo definitivo por medios de laboratorio ya que las manifestaciones clínicas son inespecíficas en cualquier estadío de la enfermedad. Las pruebas de laboratorio utilizadas para reconocer las infecciones por retrovirus humanos pueden clasificarse en directas e indirectas (Figura 3). Según persigan demostrar la presencia del virus o de sus constituyentes (Proteínas y Ácidos nucleicos) o bien la respuesta inmunitaria (Humoral o celular) por parte del huésped. FIGURA 3 Clasificación de los métodos de laboratorio para diagnóstico de infección por VIH. Métodos Directos Cultivo Viral Detección de Ácidos Nucleicos: PCR, bDNA, NASBA. Antigenemia (p24). Métodos IndirectosDetección de anticuerpos específicos. Pruebas Rápidas: Oral test. Pruebas de Screening: ELISA, Aglutinación, Inmunocromatografía. Pruebas de Confirmación y Suplementarias: WB,IFI. Investigación de inmunidad celular específica. Notas: bDNA (branched-DNA), ELISA (Enzimoinmunoanálisis), IFI (Inmunofluorescencia indirecta), WB (Western Blood), NASBA (Amplificación en la transcripción de ácidos nucleicos), PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa).
  • 5. LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Práctica 13 – VIH Página |5 PRUEBAS SEROLÓGICAS La investigación de anticuerpos en suero es la metodología más frecuentemente utilizada para la identificación de los individuos de VIH. La presencia de anticuerpos anti-VIH lejos de reflejar una exposición erradicación inmune del virus en el pasado, indica más bien el estado de portador actual. Existen diferentes tipos de pruebas para la detección de anticuerpos frente al VIH. El diseño de algunas de ellas permite realizar gran número de análisis a la vez son las denominadas pruebas de Screening. En cambio, otras son de realización más compleja aunque proporcionan mayor especificidad se utilizan para la confirmación de la reactividad en una prueba inicial de Screening. La seropositividad define mediante la demostración de anticuerpos frente a las proteínas virales con reactividad repetida en las pruebas de Screening y además, con algunas de las pruebas de confirmación 1. PRUEBAS DE SCREENING El enzimoinmunoanálisis (ELISA) es el método más utilizado como prueba de Screening los antígenos provienen del lisado viral de un cultivo (ELISA de primera generación) o bien corresponden a proteínas recombinadas (ELISA de segunda generación), que reproducen epitopos de virus, los EIA de segunda generación son más sensibles y , sobre todo, más específicos que los de segunda generación. Además, las pruebas de ELISA pueden estar diseñadas de modo indirecto o competitivo según el mecanismo por el que se reconoce la precisión de anticuerpos en la muestra problema. En general los ELISA indirectos son más sensibles y los ELISA competitivos son más específicos. En los últimos años se han desarrollado nuevas técnicas de ELISA que son más sensibles y específicas que las ELISA iniciales. Utilizan como antígenos especiales, proteínas recombinantes o péptidos sintéticos de 10 a 40 aminoácidos específicos del VIH-1 (en ocasiones, en asociación con otros del VIH-2). Las dos técnicas son ELISA de tipo sándwich (Tercera generación) y ELISA de captura (Cuarta generación). Estas pueden detectar todas las subclases de anticuerpos y no solo la IgG. Esto explica su mayor sensibilidad para reconocer la primoinfección por VIH-1, cuando la IgM es el primer marcador de la seroconversión, así como para el diagnóstico de la infección pediátrica, que cursa con IgM e IgA solo si el niño está infectado. Además del ELISA de captura es un método de gran especificidad. Permitiendo la detección simultánea de antígeno y anticuerpos, con una media de 8 días antes que los de tercera generación. En la actualidad existen más de 130 pruebas comerciales para la detección de anticuerpos frente al VIH-1 en suero. En general las pruebas aprobadas para los bancos de sangre gozan de excelente sensibilidad superior al 99,5%. PRUEBAS DE DETECCIÓN RAPIDA. Existen diversos métodos para la detección rápida de anticuerpos frente al VIH. Las pruebas de inmunoadherencia (dot-blot) son más frecuentes aunque también se han desarrollado ensayos de aglutinación. 2. En general todas ellas gozan de buena sensibilidad, especificidad y fundamentalmente acortan ventajas en aquellos lugares en donde los test diagnósticos habituales son de difícil incorporación. La gran mayoría tienen la capacidad de detectar las distintas variantes de VIH-1 y VIH-2, por lo que su uso en África y Sud-América cada vez es más extendido, especialmente para diagnósticos urgentes. La FDA aprobó hace pocos años la utilización de ensayos OralQuick con saliva para su distribución de venta libre en farmacias, este ensayo aporta la ventaja de que únicamente requiera la muestra
  • 6. LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Práctica 13 – VIH Página |6 de la saliva para su uso, sin embargo no se pude olvidar que un diagnóstico positivo tiene que ser confirmado por ELISAs especializados. PRUEBAS DE CONFIRMACION El Western-Blood (WB) es el método más empleado para la confirmación de resultados obtenidos con las pruebas de Screening. Permite discriminar frente a qué antígenos virales se dirigen los anticuerpos presentes en la muestra problema, Otras metodologías de confirmación como la Inmunofluorescencia indirecta (IFI) presenta gran complejidad y gran subjetividad, lo que dificulta su utilización sistemática como pruebas de confirmación 1. En 1990 la OMS redacta la nomenclatura vigente de las bandas de proteínas del western blood y estableció los siguientes criterios para su interpretación: la positividad en el WB para VIH-1 requiere la presencia de al menos 2 bandas de la envoltura; la negatividad resulta de la ausencia de bandas y los restantes patrones se consideran indeterminados. (Fig. 5). FIGURA 5. Causas de Wester Blood Indeterminado para VIH-1. Infección por VIH-2 Seroconversión para el VIH-1. Pacientes en estadíos muy avanzados de la enfermedad. Niños de madres seropositivas. Reactividad inespecífica. ALGORRITMOS DIAGNÓSTICOS PROPUESTOS PARA LA INFECCIÓN POR VIH Una prueba de ELISA reactiva en una ocasión para anticuerpos frente al VIH-1 debe ser repetida en la misma muestra antes de ser valorada como tal. Todas las muestras de ELISA repetidamente reactivas deben ser confirmadas con WB. Diversos estudios han demostrado que la sensibilidad y la especificidad del ELISA comercialmente son superiores al 98%, si bien, el número de falsos positivos en un grupo de bajo riesgo de infección (como los donantes) quizá no sea insignificante. Estos falsos positivos se han descrito en especial en individuos con enfermedades autoinmunes y en pacientes con historias de múltiples gestaciones o transfusiones, relacionados con la existencia de anticuerpos frente a algunos antígenos HLA de clase II. La utilización de pruebas de ELISA diseñados con antígenos recombinantes o péptidos sintéticos ha reducido de manera considerable las reacciones cruzadas y prácticamente en la actualidad una prueba de ELISA positivo es diagnóstico de infección por VIH. En la Figura 6. Se recoge el algoritmo diagnóstico recomendado para el diagnóstico de la infección por el VIH, es necesario tener en cuenta el tipo de población estudiada, ya sea donantes de sangre o población de bajo recurso ya que se han descrito falsos positivos en el WB. Aunque dicha metodología es la más generalizada para la confirmación de la reactividad inicial en una prueba de Screening puede considerarse otro tipo de estrategias diagnósticas como la confirmación mediante LIA, en casos con resultados indeterminados. En la Figura 7. El diagnóstico de la infección aguda por el VIH ha adquirido una especial relevancia según se ha ido avanzando en el conocimiento de la enfermedad. El conocer por un lado las características virológicas de las cepas (fundamentalmente la presencia de mutaciones de resistencia y el subtipo viral) que son responsables de las nuevas infecciones y por otro lado las ventajas que representa la instauración de terapia antiretroviral en este período ha hecho que se
  • 7. LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Práctica 13 – VIH Página |7 adopten nuevas estrategias diferentes a fin de diagnosticar estas infecciones. Estas incluyen además de la realización de viremia plasmática para los casos previos a la seroconversión la utilización de test de ELISA especiales y estándar para el diagnóstico de la enfermedad ante un accidente laboral o un contacto sexual de riesgo. FIGURA 7. ALGORITMO DIAGNOSTICO DEL VIH EN LABORATORIO. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA PRUEBAS DE SCREENING ELISA INDIRECTO. Consta de las siguientes etapas: 1. Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. 2. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados. 3. Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 4. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. 5. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 6. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. 7. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. ELISA es una prueba de alta sensibilidad (99,5%), por lo que ante la mínima presencia de anticuerpos del virus de VIH, e incluso de elementos similares, arrojará un resultado positivo. Esta misma sensibilidad puede dar como resultado "falsos positivos" ante otros virus similares. Si la prueba de ELISA sale negativa, no se hacen más pruebas, especificidad (99.2%). Valor predictivo positivo (98.3%) y valor predictivo negativo (99.4%).
  • 8. LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Práctica 13 – VIH Página |8 AUTOEVALUACION E INVESTIGACION 1. Que prueba realizaría para identificar a pacientes con VIH en una población amplia de riesgo? Inmunocromatogrfia HIV 1 y HIV2. Micro Elisa VIH 1 y 2 Western Blood. Carga Viral Microelisa Rápido VIH1 y VIH2. 2. Enumere los 3 genes estructurales más importantes del VIH. 3. Enumere al menos 10 enfermedades, comorbilidades o signos clinicos que frecuentemente se encuentran asociadas a los pacientes portadores de VIH antes de la fase de SIDA? 4. Qué criterios debe reunir un paciente para iniciar TARV (Terapia Anti-retro Viral). 5. Enumere al menos 10 enfermedades que frecuentemente se encuentran asociadas a los pacientes con SIDA? PROCEDIMIENTO PARA HIV1/2 ELISA Etapa 1 Añadir al MIC, 60ul del control WCON: Solución de trabajo de conjugado en las celdas a usar Añadir 30ul del control NEGATIVO-NC, POSITIVO- PC y 30ul de muestra en cada celda de reacción, excepto en el blanco Mezclar cuidadosamente(solución cambia de color),cubrir MIC con cintas adhesivas. Incubar el plato a 37+/- 1ºC, por 90’ Lavar el plato Ciclo de 8 veces. Solución Wash 350ul Etapa 2 Añadir 50ul de Sustrato Añadir 50ul de Sustrato de Solución A en cada de Solución B en cada celdilla celdilla
  • 9. LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Práctica 13 – VIH Página |9 Cubrir MIC con cintas adhesivas. Incubar el plato por 30 minutos de 18 a 25ºC en la obscuridad Añadir 100ul de STOP (2N H2SO4) en cada celdilla. Mezclar cuidadosamente Determinar la Absorbancia a 450nm, y usando una longitud de onda de referencia de 620nm. BIBLIOGRAFIA 1. Global report 2010. Geneva: UNAIDS, 2010. (http://www.unaids.org/globalreport/documents/20101123_GlobalReport_full_en.pdf.) 2. Branson BM. State of the art for diagnosis of HIV infection. Clin Infect Dis 2007;45:Suppl 4:S221. 3. Eshleman SH, Khaki L, Laeyendecker O, et al. Detection of individuals with acute HIV-1 infection using the ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo assay. J Acquir Immune Defic Syndr2009;52:121-124. 4. Hladik F, McElrath MJ. Setting the stage: host invasion by HIV. Nat Rev Immunol2008;8:447-457. 5. Fiebig EW, Wright DJ, Rawal BD, et al. Dynamics of HIV viremia and antibody seroconversion in plasma donors: implications for diagnosis and staging of primary HIV infection. AIDS 2003;17:1871-1879. 6. Weiss HA, Dickson KE, Agot K, Hankins CA. Male circumcision for HIV prevention: current research and programmatic issues. AIDS 2010;24:Suppl 4:S61-S69 7. Emau P, Jiang Y, Agy MB, Tian B, Bekele G, Tsai CC. Post-exposure prophylaxis for SIV revisited: animal model for HIV prevention. AIDS Res Ther 2006;3:29-29. 8. Keele BF, Giorgi EE, Salazar-Gonzalez JF, et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.
  • 10. LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Práctica 13 – VIH P á g i n a | 10 9. Lee HY, Giorgi EE, Keele BF, et al. Modeling sequence evolution in acute HIV-1 infection. J Theor Biol 2009;261:341-360. 10. Palmer S, Wiegand AP, Maldarelli F, et al. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J Clin Microbiol 2003;41. 11. Damond F, Avettand-Fenoel V, Collin G, et al. Evaluation of an upgraded version of the Roche Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1 test for HIV-1 load quantification. J Clin Microbiol 2010;48:1413-1416. 12. Sickinger E, Jonas G, Yem AW, et al. Performance evaluation of the new fully automated human immunodeficiency virus antigen-antibody combination assay designed for blood screening. Transfusion 2008;48:584-593. 13. Haase AT. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature2010;464:217-223. 14. Hladik F, Sakchalathorn P, Ballweber L, et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity 2007;26:257-270. 15. Boggiano C, Littman DR. HIV's vagina travelogue. Immunity 2007;26:145-147. 16. Zhang Z, Schuler T, Zupancic M, et al. Sexual transmission and propagation of SIV and HIV in resting and activated CD4+ T cells. Science 1999;286:1353-1357[Erratum, Science 1999;286:2273.] 17. Zhang ZQ, Wietgrefe SW, Li Q, et al. Roles of substrate availability and infection of resting and activated CD4+ T cells in transmission and acute simian immunodeficiency virus infection. Proc Natl Acad Sci. 18. Li Q, Duan L, Estes JD, et al. Peak SIV replication in resting memory CD4+ T cells depletes gut lamina propria CD4+ T cells. Nature 2005;434:1148-1152.
  • 11. LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Práctica 13 – VIH P á g i n a | 11 Universidad Central del Ecuador Facultad de Ciencias Médicas Escuela de medicina PRE-REQUISITOS DE MICROBIOLOGIA NOMBRE: DOCENTE: FECHA: AYUDANTE: PARALELO: GRUPO: PREGUNTA 1. PREGUNTA 2 PREGUNTA 3 PREGUNTA 4