1. La diagnosi dei giallumi della vite nell’ambito
dei monitoraggi ufficiali
Martedi 31 gennaio 2012
Convegno Termovit - Un progetto per la termoterapia in Lombardia
Torrazza Coste PV
Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008

2. Fitoplasmi maggiormente riscontrati in viti affette da giallumi
Flavescenza dorata FD
16Sr(V)-C/D Candidatus phytoplasma vitis
Legno Nero LN
16Sr(XII)-A Stolbur C. Phytoplasma solani
Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008

3. Attività di monitoraggio e controllo del SFR
•
D.M. del 31/5/2000 “Misure per la lotta obbligatoria contro la Flavescenza
dorata della vite”
Controllo barbattellai
campi PMM PMP
Controllo vigneti
Monitoraggio
diffusione malattia
Espianto viti infette
Controllo vettore
Progetti di ricerca
Prove di campo
•
Analisi di laboratorio
Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008

4. Analisi di laboratorio
punti critici
•
Fasi del procedimento di analisi
campionamento
Protocollo analisi
Tecnica e strumento
Esperienza del
tecnico
•
Sensibilità, specificità, affidabilità, ufficialità
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5. campioni di vite infette da giallumi analizzati dal 2004
4000
2000
campioni
0
2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011
campioni 154
359
243
318
227
219
219
total
e
330 2069

6. FD e LN in Lombardia dal 2004 al 2011
risultati analisi di laboratorio

7. analisi su PMM nel 2011
16
14
12
10
8
6
Mantova
4
Pavia
2
0
N°
N°
campioni campioni
positivi FD positivi LN
N°
campioni
positivi
Misti
numero
campioni
negativi
per virus e
giallumi
Numero
campioni
affetti da
virus
Totale
campioni
analizzati
per
provincia

8. Protocollo analisi ufficiale Eppo PM 7/79 2007
Nervatura fogliare
Patogeno floematico
1- Estrazione DNA totale
2- PCR per rilevare la presenza
di fitoplasmi marcatori gene
16S
1. PCR diretta P1P7
2. PCR nested 16SrV
16SrI
DNA
amplificato
del
fitoplasma
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9. Protocollo analisi ufficiale Eppo
Fase 3
Taglio enzimatico RFLP per distinguere il tipo di fitoplasma: FD, LN, AY, EY.
2 giorni
30 campioni
Profili specifici ed identificativi dei diversi fitoplasmi in base a numero delle
bande e loro posizione sul gel
Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008

10. Ricerca di un protocollo alternativo
•
•
•
•
Affidabile
Specifico e sensibile
Veloce ed economico
Ufficialmente e legalmente riconosciuto
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11. Protocollo alternativo
Analisi real time PCR




PCR veloce: utilizza un solo ciclo
reaI time: i risultati sono visualizzati in tempo reale
sensibile: rileva fino ad 1 sola molecola di DNA target
specifica: chimica Taqman, primers e sonda specifiche
Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008

12. Analisi real time PCR
Valori di fluorescenza
Numero di cicli
Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008

13. sviluppo saggio real time PCR
progetto DIACERVIT
– DIA.CER.VIT, 2008-2009 finanziato da Regione Lombardia, Unimi
Istituto Patologia Vegetale Dr.ssa Casati e Dr. Durante, Fondazione
Minoprio Lab Fitopatologico
– Sviluppo specifico saggio per il rilevamento di FD e LN
•Primer and MGB probe disegnati su parziale sequenza
dell’operone S10-spc
•Sequenziamento di 8 isolati di fitoplasmi diversi
•Ottimizzazione del saggio
•Valutazione dell’affidabilità

14. sviluppo saggio real time PCR progetto DIACERVIT
Confronto con protocollo standard EPPO
direct PCR primer P1/P7
Nested PCR R16(V/I)F1/R1
RFLP with BfaI/MseI
Viti
sintomatiche
FD
BN
virus
negative
285
139
109
5
32

15. saggio real time PCR
progetto DIACERVIT
102
106 105 104 103 102
106
Dilution of the standard curve
standard curve
Specificity
Sensitivity
Efficiency
e=101/-S-1
16SrV - C/D
2 target
molecule Ct
98.6%

16. saggio real time PCR LN
progetto DIACERVIT

17. saggio real time PCR LN
progetto DIACERVIT
Media Ct cycle threshold
(ciclo soglia) campioni positivi
26<39

18. saggio real time PCR FD
progetto DIACERVIT

19. saggio real time PCR LN
progetto DIACERVIT
Media Ct cycle threshold
(ciclo soglia) campioni positivi
26<37

20. risultati di valutazione saggi real time PCR
Specificity
Efficiency
e=101/-S-1
Sensitivity
Reliability of assay
results
Reference
data
results
Reference
data
results
Reference
data
results
Reference
data
SYBR green
FD Galletto
et al 2005
16SrV*
16SrV*
(20 fg)
Ct 27.89
(20 fg)
Ct 27.86
97%
Data not
shown
100%**
94%
Taqman FD
Angelini et
al. 2006
No
amplificat
ion
16SrV
Not tested
10-6 dilution
infected
periwinkle
Not
tested
94.6%
0%
100%
16SrXII-A
(0.5 ng) 106 dilution
infected
periwinkle
(0.25 ng) 106 dilution
infected
periwinkle
98%
96.5%
100%**
100%
Taqman BN
Angelini et
al. 2006
16SrXII-A
Taqman FD DIACERVIT
unpublished
Specificity
Sensitivity
Efficiency
e=101/-S-1
16SrV - C/D
2 target molecule Ct
98.6%
* Specificità relativa al gruppo 16SrV
** il saggio di real time PCR si è dimostrato maggiormente sensibile della nested PCR , dati elaborati su
285 campioni

21. campioni di vite analizzati per fitoplasmi in real time PCR
4000
2000
campioni
0
2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011
4 ore
45 campioni
total
e
campioni 154 359 243 318 227 219 219 330 2069

22. Laboratorio fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio
v.le Raimondi 54 Vertemate con Minoprio CO
fitolab@regione.lombardia.it