1ª Aula Prática de citologia                    Identificação de proteínas e glicídios   O amido quando tratado com Lugol,...
Pipeta pasteur;      Lâminas;      Microscópio óptico;      Estante.      PROCEDIMENTO           Colocou-se em cada tubo, ...
Leite em pó:      Coloração inicial: branco;      Coloração final: amarelo.Água destilada:      Coloração inicial: transpa...
Introdução    Vimos no experimento anterior que a solubilidade das proteínas em meioaquoso deve-se, em grande parte, à dis...
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2. adicionar 0,5 ml da solução deacetato de chumbo    3. adicionar 5 ml de águadestilada;    4. observe e interprete osres...
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1ª aula prática proteínas

  1. 1. 1ª Aula Prática de citologia Identificação de proteínas e glicídios O amido quando tratado com Lugol, modifica sua coloração, pois o amido reagecom o iodo na presença de iodeto, formando um complexo de cor azul intensa,sendo visivel em concentraçoes minimas de iodo. Após o tratamento com Lugol, pode-se observar os granulos do amido nomicroscópio óptico, para a detecção se existe uma alteração no alimento compostode amido, deve-se verificar os granulos e compará-los, se estiverem diferentes,existe grande possibilidade de adição de outros compostos. O amido é uma mistura de dois polissacarídeos estruturalmente diferentes:amilose e amilopectina. A composição do amido é α-amilose, uma cadeia linear deresíduos de glicose unidos por ligações glicosídicas α-1,4 (que conferem a moléculauma estrutura helicoidal) e de amilopectina (proteína menos hidrossolúvel que aamilose), de cadeia principal idêntica a amilose, além disso contém ramificaçõesformadas, como no glicogênio, por ligações glicosidicas α-1,6. Na amilopectinaestas ramificações ocorrem a cada 30 ou 20 resíduos de glicose, enquanto noglicogênio , a freqüência é, em média, de uma ramificação a cada 10 resíduos.MATERIAISAçúcar;Farinha;Maizena;Arroz;Leite em pó;Água destilada;Lugol;Tubos de ensaio;Pistilo e gral;Bastão de vidro;
  2. 2. Pipeta pasteur; Lâminas; Microscópio óptico; Estante. PROCEDIMENTO Colocou-se em cada tubo, um alimento diferente, menos o arroz, estes alimentos foram dissolvidos em água destilada e anotada a coloração inicial. O arroz foi colocado no gral e amassado, com água destilada e o líquido encontrado colocou-se em outro tubo de ensaio. Em cada tubo de ensaio adicionou-se 2 gotas de lugol e foi homogenizado e novamente anotou-se a coloração. 5 RESULTADOSAçúcar: Coloração inicial: transparente; Coloração final: amarelo.Farinha: Coloração inicial: branco translúcido; Coloração final: roxo escuro.Maizena: Coloração inicial: branco opaco; Coloração final: roxo claro.Arroz: Coloração inicial: branco leitoso;Coloração final: roxo claro.
  3. 3. Leite em pó: Coloração inicial: branco; Coloração final: amarelo.Água destilada: Coloração inicial: transparente; Coloração final: amarelo cítrico.Coloração final: roxo claro.Leite em pó: Coloração inicial: branco; Coloração final: amarelo.Água destilada: Coloração inicial: transparente; Coloração final: amarelo cítrico. 6 CONCLUSÃO Através deste experimento concluímos que apenas a maizena, o arroz e a farinha são amido, no final do mesmo, podemos encontrar estes grânulos no microscópio Propriedades gerais das proteínas Objetivos - reconhecer as proteínas como moléculas eletricamente carregadas - analisar a influência do pH sobre essas cargas - reconhecer os grupamentos responsáveis pela solubilidade das proteínas em água - identificar os agentes que podem alterar essa solubilidade
  4. 4. Introdução Vimos no experimento anterior que a solubilidade das proteínas em meioaquoso deve-se, em grande parte, à distribuição das cargas elétricas ao longo damolécula. Nesse sentido, se a interação proteína-proteína é grande e a interaçãoproteína - água é pequena, a proteína tenderá a ser insolúvel.Uma das maneiras de promover a precipitação de uma proteína é atingir seu pontoisoelétrico. Porém, existem outros fatores que influem de maneira importante nessapropriedade física das proteínas, como a ação de ácidos, bases, sais e solventesorgânicos. Além disso, podemos incluir a temperatura como um agente que podeser utilizado para diminuir a solubilidade de uma proteína. Vamos lá:3. Princípios teóricos e procedimento experimentala) Precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito da força iônica) Quando adicionamos sais neutros a uma solução, ocorre um aumento da forçaiônica do sistema. Assim, quando adicionamos pequenas quantidades de sal a umasolução contendo proteínas, as cargas provenientes da dissociação do sal passam ainteragir com as moléculas protéicas, diminuindo a interação entre elas.Conseqüentemente, temos um aumento da solubilidade da proteína no meioaquoso. as interações proteína - proteína, favorecendo a solubilidade das mesmas.A esse fenômeno dá-se o nome de "salting-in". Esse efeito, porém, não se estendeindefinidamente. Em condições de elevada força iônica, decorrente da adição degrandes quantidades de sal, temos o efeito contrário. O que acontece? Imagine uma solução aquosa de proteína à qual foi adicionada uma certaquantidade de sal neutro. A água, que apresenta um grande poder de solvatação,passa a interagir com as duas espécies: as proteínas e os íons provenientes dadissociação do sal. Porém, as moléculas de água apresentam maior tendência desolvatação de partículas menores (nesse caso, os íons). As moléculas de água,ocupadas em sua interação com os íons, "abandonam" a estrutura protéica. Comoconseqüência, temos: maior interação proteína-proteína, diminuição da solubilidadeem meio aquoso e, conseqüentemente, precipitação da proteína. A esse fenômenode insolubilização da proteína em decorrência de um considerável aumento da forçaiônica do meio dá-se o nome de "salting-out". A precipitação de proteínas pela alta concentração de sais é um processo muitoimportante para a separação de misturas complexas de proteínas, uma vez que aconcentração de sal necessária para precipitação é diferente para cada proteína. a.1. Material a) Reagentes e soluções b) Vidraria e instrumental - solução de clara de ovo (pode ser utilizada outra solução - 01 tubo de ensaiode proteína)* - pipetas (vidro ou plástica) - solução saturada de sulfato de amônio [(NH4)2SO4]** - solução de NaCl - água destilada * Preparo da solução de clara de ovo: 1 volume de clara + 4 volumes de NaCl1%
  5. 5. ** Preparo da solução saturada de (NH4)2SO4:7,7g do sal em 10 ml de águadestilada a.2. Procedimento 1. Em um tubo de ensaio, colocar 2ml da solução de proteínas; 2. adicionar, deixando escorrerpelas paredes do tubo, 2 ml da soluçãode sulfato de amônio; 3. observe. Veja as fotos desse experimento 4. Misture o conteúdo do tubo (porinversão) e anote os resultados. 5. Repita as etapas anterioresusando NaCl ao invés de (NH4)2SO4. Oque você observou?b) Precipitação por sais de metais pesados e por ácidos fortes Os cátions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ formamprecipitados insolúveis de proteínas, denominados de acordo com o elementoformador (exemplo: proteinato de mercúrio, proteinato de chumbo, etc.). Essaprecipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI). Issoporque, acima do pI, a carga líquida sobre a proteína é negativa (ver determinaçãodo ponto isoelétrico da caseína), favorecendo a interação com os cátionsprovenientes do sal. Então não é possível promover a precipitação de uma proteína abaixo do pontoisoelétrico? A resposta correta seria: não com sais... A precipitação abaixo do pontoisoelétrico pode ser feita, sim, mas através da adição de ácidos fortes. Comparando com o mecanismo anterior: quando a proteína está abaixo do seupI, a carga líquida total da molécula é positiva. Isso facilita a interação da moléculacom os ânions provenientes de ácidos como o tunguístico, o fosfotunguístico epírico. Nas duas situações o precipitado pode ser ressolubilizado através de alteraçõesdo pH. b.1. Material a) Reagentes e soluções b) Vidraria e instrumental - solução de proteínas preparada acima - 01 tubo de ensaio - solução de (CH3COO)2Pb.3H2O (acetato de chumbo) a 20% - pipetas (vidro ou plásticas) - solução de ácido tricloroacético (CCl 3COOH) 10% - água destilada b.2. Procedimento a) Precipitação por sais de metaispesados Veja as fotos desse experimento 1. Em um tubo de ensaio, colocar1ml da solução de proteínas;
  6. 6. 2. adicionar 0,5 ml da solução deacetato de chumbo 3. adicionar 5 ml de águadestilada; 4. observe e interprete osresultados. b) Precipitação por ácidos Repita o procedimento anterior, substituindo a solução de acetato de chumbopela solução de ácido tricloroacético a 10%.c) Precipitação por ação do calor (desnaturação) As proteínas possuem uma estrutura tridimensional (conformação) bemdefinida, da qual dependem fundamentalmente suas propriedades físicas, químicase biológicas. Essa estrutura é relativamente sensível à ação do calor, que causadesorganização das cadeias peptídicas, com conseqüente alteração conformacional.Esse fenômeno recebe o nome de desnaturação, e altera as estruturasquaternária, terciária e secundária da proteína sem afetar sua estrutura primária. A desnaturação promove alterações que diminuem a solubilidade da proteína,levando à sua precipitação. Essa precipitação é máxima no ponto isoelétrico daproteína e pode sofrer alterações pela adição de sais. c.1. Material b) Vidraria e instrumental a) Reagentes e soluções - 01 tubos de ensaio - solução de proteínas - pipeta (vidro ou plástica) c.2. Procedimento 1. Colocar 5 ml da solução deproteínas em um tubo de ensaio; 2. deixar o tubo em banho-mariafervente por 5 minutos (o tubo Veja as fotos desse experimentotambém pode ser aquecido direto nachama de um bico de Bunsen); 3. retire o tubo do banho, observee anote os resultados.d) Precipitação das proteínas por solventes orgânicos A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em água.Isso acontece porque a capacidade de interação com as partículas de soluto édiferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de interação dosolvente com o soluto é denominada constante dielétrica. A água apresentaconstante dielétrica bastante elevada (aproximadamente 80). Mas o que isso querdizer? Vamos utilizar novamente a imaginação. Numa solução contendo,exclusivamente, água e moléculas protéicas temos: interação água - proteína einteração proteína-proteína. Nesse caso, podemos afirmar com certeza que oprimeiro tipo de interação prevalecerá sobre o segundo porque a água possui
  7. 7. grande capacidade de separação das partículas do soluto (constante dielétricaelevada).Para os solventes orgânicos a situação é um pouco diferente... Como esse tipo desolvente apresenta valor de constante dielétrica bem inferior à da água, a interaçãoproteína-proteína "vence" o poder de solvatação da água (interação água-proteína).A proteína precipita. A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura. Ossolventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante úteisna separação de misturas de proteínas. A temperaturas mais elevadas essessolventes podem levar à desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio eestabelecimento de interações apolares, importantes na manutenção daconformação protéica. c.1. Material a) Reagentes e soluções b) Vidraria e instrumental - solução de proteínas - 04 tubos de ensaio - etanol (CH3CH2OH) 95% gelado - pipetas (vidro ou plásticas) - acetona (CH3COCH3) gelada - cloreto de sódio (NaCl) sólido - água destilada c.2. Procedimento OBS: trabalhar a baixa temperatura 1. Tome dois tubos de ensaio ecoloque, em cada um, 2 ml da soluçãode proteínas; 2. adicionar 4 ml de etanol geladoa cada tubo; 3. agite; 4. em um dos tubos, coloque umapequena quantidade de NaCl sólido,sob agitação; Veja as fotos desse experimento 5. observe e responda: qual oefeito do álcool sobre a proteína napresença e na ausência do eletrólito? 6. Adicione 6 ml de água destiladae observe. 7. Repita as etapas anterioressubstituindo o etanol pela acetona; 8. compare os resultados.

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