Mapas bioinformática

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  • Perspectiva historica
  • Dizer o que é um cM Fazer digitalizaçao da pagina 214, tabela 8.1 p mostrar os diferentes graus de resoluçao
  • Explicar porque e que precisamos de cd um destes items: O tamanho do genoma humano e 25xs maior do q qq um q se tivesse sequenciado ate a data e cm tal apresentava desafios pq seria necessario analisar um maior no de clones e devido a sua complexidade, nomeadamente a existencia de regioes genomicas ricas em repetiçoes, era dificil destinguir verdadeiras sobreposiçoes de clones
  • The challenge of sequence assembly was minimized by restricting random shotgun sequencing to individual clones Vantagens desta abordagem: Seleccionar os clones para sequenciar  garante cobertura total do genoma e elimina a redundancia de sequenciação – simplificação do processo
  • Utilizaram marcadores de varios mapas geneticos e esses marcadores foram utilizados p hibridar c as replicas da biblio RPCI-11. Posicionaram-s 96,283 BACs nos diferentes cromossomas utilizando 13, 695 marcadores O ePCR é um programa que procura por STS nas sequencias porque identifica quais e que são os primers associados com akele determinado STS, ou seja diz-nos qual e a sequencia dos primers e qual a distancia entre eles. Assim que podessemos associar os clones sequenciados c o padrao de restriçao deles mesmo podiamos utilizar o seu conteudo em marcadores determinado por ePCR p orientar e ordenar os contiguos com mais confiança. Electronic PCR (e-PCR) is computational procedure that is used to identify sequence tagged sites(STSs), within DNA sequences. e-PCR looks for potential STSs in DNA sequences by searching for subsequences that closely match the PCR primers and have the correct order, orientation, and spacing that could represent the PCR primers used to generate known STSs. Houve integraçao neste mapa da informaçao de outros mapas regionais de outros centros genomicos
  • Posiçoes cromossomais: Os que faltam dos 96 ou falharam em hibridar ou associaram-se c varias bandas cromossomais Dos 87 que ficaram atribuidos a uma única banda, 82 estavam em total concordancia c o local atribuido pls STS, 1 deles tinham-lhe sido atribuidos 2 locais possiveis c base nos STS e os restantes 4 eram clones associados a contiguos que não tinham marcadores ainda postos no genoma e que ficaram axim localizados. Ordem dos clones: Comparamos o mapa do crom 12 em relaçao a STS com o mapa do mesmo crom mas de restriçao p ver se a ordem que obtinhamos p os clones era o mesmo nos dois casos. Ambos os mapas foram feitos a partir de RPCI-11 mas independentemente um do outro. Eles eram concordantes e ainda davam informaçao complementar porque preenchiam os gaps um do outro, apesar de alguns serem comuns aos dois Enqt o dos STS era melhor na ancoragem e orientaçao dos contiguos o de restriçao era melhor na representaçao do genoma Dupli e rep: Nas duplicaçoes por xs peq diferenças no padrao das bandas permitiu separar repetiçoes complexas. No entt, na gd maioria vamos ter de ter dados mais conclusivos sobre a sequencia final p poder clarificar as informaçoes sobre estas regioes Gaps: Podem aparecer porque a qtt de sobreposiçao e peq d+ p ser detectada e so o sera quando tivermos toda a sequencia, porque consideramos cm uma so regiao o k na realidd são repetiçoes de uma regiao ou porque há clones que não tao tao representados nas BAC e PAC e que seriam mais detectados se tivessemos c uma biblio de YAC. Representatividade: Foram analisados os cromossomas 21 e 22 Por metodos in silico geraram-se clones do crom 21 c cerca de 175 kb que se sobrepunham por 40% e depois estes foram digeridos por sua x c hind III e foi ver-se se o padrao era coincidente c a base de dados FPC. 98% destes clones tinham clones relacionados na FPC. Nos dois crom há cerca de 1,6% que corresponde a gaps e no total dos 2 conhecemos cerca de 96%. Extrapolando, estes dois crom são 3% do genoma e razoavel dizer que no restt o grau de representatividd e o mm. BAC-by-BAC hierarchical sequencing: O genoma e clivado numa colecçao de grandes fragmentos, entre 40 e 200 kbps designados de BACs. A localizaçao dos BACs ao longo do genoma e mapeado (cm não diz). Um caminho de BACs e escolhido (minimal tiling path) de maneira a cd base do genoma estar representada pl menos num BAC e a sobreposiçao entre BACs e minimizada. Cd BAC e sequenciado pl metodo shotgun. Coverage (redundant sampling)
  • Mapas bioinformática

    1. 1. Mapas paratransmissão genética Prof. Dra Adriana Dantas UERGS – Bento Gonçalves,RS
    2. 2. IntroduçãoOs mapas genômicos representam ainformação genética cartograficamenteem cada cromossomoFornece toda as informações relacionadasao dogma central e ao metabolismoorgânico e funcional necessária paraaplicação biológicaConsiste em localizar um gene ou umlocus específico numa região determinadado genoma, num cromossoma ou numabanda cromossômica.
    3. 3. Mapeamento do Genoma Mapa Genético: mapa que ilustra a ordem dos genes num cromossoma e a distancia relativa entre esses mesmos genes/marcadores moleculares. A unidade de distancia é 1 cM. Mapa Físico: engloba diversos tipos de mapas, com maior ou menor resolução, mas que informam sempre a distancia em bp entre genes/marcadores moleculares
    4. 4. Cartografia cromossômica
    5. 5. Cariótipos, Bandas e ideogramas
    6. 6. Tipos de mapas genômicosMapa de ligação genéticaMapa de contíguosMapa de restriçãoMapas físicosMapa de bandeamento de cromossomosMapeamento do plasmídeoMapeamento da mitocôndriaMapeamento do cloroplastoMapeamento RibossômicoMapas por clonagem posicionalMapeamento por FISHMapas de Alta ResoluçãoSintenia de mapas
    7. 7. Projeto do Genoma Humano O Genoma Humano tem 3.2 Gb (3.200.000.000 bp) Objetivos do Projeto do Resolução Genoma Humano Construir um Mapa Genético 2 Mb (2.000.000 bp) detalhado do Genoma Humano Construir um Mapa Físico 0,1 Mb (100.000 bp) completoObter todo o Genoma Humano na 5 Kb (5000 bp) forma de clonesDeterminar a sequência completa 1 bp do Genoma Identificar todos os genes
    8. 8. 280.000 ESTsEm setembro de1996, os pesquisadores descreveram comotinham gerado e analisado 280.000 seqüências expressas porcaracteres (ou ESTs).ESTs são pequenos fragmentos da seqüência copiada dasmoléculas do mRNA. Como esta, representam fragmentos dosgenes.O total de 280.000 ESTs excede distante o número prováveldos genes no genoma humano. (as estimativas para o númerototal dos genes variam, mas na primavera de 2000, gene asuposição dos pesquisadores era ao redor 60.000.)
    9. 9. Mapeamento genético(linkage ou mapeamento meiótico)É a descrição da ordem relativa demarcadores genéticos em “linkage groups”,na qual a distância entre os marcadores éexpressa em unidades de recombinação.Locais muito próximos raramente sãoseparados durante a recombinaçãomeiótica.A probabilidade de separação é muito baixa.
    10. 10. A abordagem básica do mapeamentogenético para identificar genes relacionados a características herdadas é analisar uma série de marcadores polimórficos em populaçoes que segreguem esses genes de interesse.
    11. 11. Genes Ligados Linkage• Quando dois ou mais genes, responsáveis por diferentes características, estão localizados em um mesmo cromossomo, a herança é chamada de Vinculação Gênica.• Nestes casos a quantidade de gametas e portanto a freqüência da descendência apresentarão diferenças em relação ao diibridismo já que a incidência do crossing-over será fundamental.• Crossing-Over ou permuta é a troca de partes entre cromossomos homólogos durante a meiose e é um dos principais fatores para a variabilidade genética.
    12. 12. Comparação Diibridismo/Linkage Diibridismo (AaBb) A a B b GametasA B A b a B a b 25% 25% 25% 25%
    13. 13. Comparação Diibridismo/Linkage Linkage (AaBb) A a B b Gametas A a A a B b b B Parentais Recombinantes
    14. 14. Genes Ligados - Linkage• Na herança dos genes ligados, a freqüência dos gametas de um heterozigoto depende da taxa de crossing-over ou taxa de recombinação que ocorre entre os cromossomos homólogos.• Os Gametas Parentais são formados mesmo que não haja recombinação e aparecem em maior quantidade.• Os Gametas Recombinantes são formados apenas se houver permuta e aparecem em menor quantidade.• A Taxa de Crossing é expressa em porcentagem e corresponde a freqüência de gametas recombinantes formados na gametogênese.
    15. 15. Genes Ligados - Linkage• Na vinculação gênica a posição dos genes no heterozigoto (AaBb) pode ser Cis ou Trans.• Estas posições também podem ser utilizadas para se definir quem são os gametas parentais e os recombinantes. A B A b a b a B Posição CIS Posição TRANS
    16. 16. Unidades de Recombinação (U.R.)• Mapa genético ou cromossômico é a representação da posição dos genes no cromossomo.• Está diretamente relacionada a taxa de crossing.• Unidades de Recombinação (U.R.) ou Morganídeos (M) são as unidades usadas para determinar a posição dos genes no cromossomo e correspondem a taxa de crossing.• Exemplo: Em um cromossomo há a seguinte freqüência de recombinação entre os genes A,B,C e D: A-B  45% A-C  20% C-B  25% B-D  5% C-D  20% A-D  40% Qual a posição dos genes no cromossomo?
    17. 17. Rearranjos de DNAA combinação particular de genes presentes num indivíduoé pode ser alterada por processos de recombinação.Recombinação geral ou recombinação homóloga:Ocorre entre um par de seqüências homólogas de DNA,usualmente entre duas cópias do mesmo cromossoma.Recombinação homóloga ocorre durante a meiose –crossing over – com troca se segmentos de DNA entrecromossomas materno e paterno.Recombinação homóloga é também essencial paraqualquer célula em divisão, para corrigir o DNA em locaisem há interrupção prematura do “fork” de replicação.
    18. 18. MAPAS DE LIGAÇÃO GENÉTICA pai mãe A a a a B b b b R RA a a a a a A a A ab b B b b b B b B b filho-1 filho-2 filho-3 filho-4 filho-5 Recombinantes = 2 em 5 meioses (40%), ou 40 cM
    19. 19. Como avaliar a taxa de recombinaçao?A taxa de recombinação entre cromossomashomólogos (paterno e materno) é analisada pelaidentificação individual de cada parental.Realizada por meio da identificação de loci quedemonstram variação polimórfica.Locus polimórfico é aquele que apresenta muitosalelos diferentes, e o alelo menos freqüente deve teruma freqüência superior a 1% na população.Locus polimóficos funcionam como marcadores .genéticos
    20. 20. CaracterísticasUm vez identificado os sítios (loci) polimórficos numcromossomo, é possível verificar, analisando a prole, se houverecombinação entre dois sítios específicos ou não.O indivíduo informativo é aquele que é heterozigoto para osloci analisados. Isto é feito tanto por meio da análise depedigrees como de análise da progenia proveniente decruzamentos controlados.A unidade padrão de distância genética é o centimorgan(Thomas Hunt Morgan): porcentagem da progenia na qual umevento de recombinação tenha ocorrido entre duas marcasgenéticas.
    21. 21. Cromossomos individuais em muitas espécies animais tendem a tercerca de 100 cM de comprimento (100 x 106 pb)Assim, ocorre um “crossover” por cromossomo por geração.Marcadores localizados em cromossomos diferentes têm 50% dechance de “co-segregarem”, estando a 50 cM de distância.50 cM é o limite mínimo para se caracterizar dois marcadorescomo pertencentes ao grupo de ligação (“linkage group”) – ou aomesmo cromossomo.Ainda assim, é possível, dois marcadores que se recombinem em 50%das vezes podem estar no mesmo grupo de ligação, desde queestejam relacionados a um terceiro marcador que mostre menos de50% de recombinação com cada um dois primeiros marcadores.
    22. 22. Definiçõesθ = ‘theta’= Freqüência de recombinação1 unidade de mapa = distância entre osmarcadores que representam 1% derecombinaçãoUnidade de distância genética = “centiMorgan’(cM)1cM = 1% de recombinaçao 1.000.000pb1 cM = 1Mb
    23. 23. Marcadores genéticosConsiderados atributos do DNA: Uma seqüência específica previamente identificada em um dado locus (sequence tags) Repetições simples (micro-satélites) Polimorfismo de restrição SNP
    24. 24. Mapeamento por bandeamento (Citogenética molecular)A citogenética clássica desenvolveu-se principalmente apartir do início do século passado e seu progressoacompanhou o aprimoramento de técnicas eequipamentos de microscopia.É a ciência que estuda os constituintes celularesportadores da informação genética (cromossomos).Compreende qualquer estudo relativo ao cromossomo,em suas diferentes formas, tanto no que diz respeito amorfologia, organização, função e replicação quanto notocante à sua variação e evolução.
    25. 25. Aplicações dos “Corpos corados”“corpos corados” estão cada vez mais “brilhantementecorados”, em cores e pseudo-cores das mais variadas.A obtenção de bons resultados depende do perfeito domínio dediferentes técnicas de coloração.Na citogenética molecular, a análise cromossômica tem sido degrande importância para o entendimento da evolução, genéticae estabilidade cariotípica dos materiaisestudados.A implantação de técnicas de bandeamento, que permitem avisualização de blocos de coloração diferenciada (bandas).
    26. 26. Como fazer?Muitos corantes que têm uma afinidade pelo DNA, fluorescem sob aluz ultravioleta.Cada cromossomo mostra zonas brilhantes e escuras, ou bandas,que são específicas em tamanho e localização.Tratamento com álcalis proporciona às células uma coloração densada região do centrômero, e isto produz o bandeamento C, que éespecífico para heterocromatina constitutiva.A região centromérica que inclui o DNA repetitivo, responde apenasà técnica de bandeamento C, assim como qualquer região intercalarque contenha DNA repetitivoOs bandeamentos Q, G e C são especialmente importantes para acitogenética,porque permitem identificar pequenas variaçõesestruturais, como deleções,duplicações, inversões, geralmenterelacionadas com determinadas anomalias do desenvolvimento.
    27. 27. Mapa de bandeamento cromossômico(n = 2) em metafase, ilustrando o cariótipo normal e de variações numéricas e estruturais No cariótipo normal, com dois grupos de ligação (1 e 2):NOR: região organizadora donucléoloT: telómeroS: satélitep e q: braços dos cromossomasCada fórmula cromossómicacontém primeiro o númerototal de cromossomas, seguidode uma lista das anomalias,com os cromossomasidentificados pelos respectivosnúmeros.
    28. 28. Mapa padrão debandeamento de cadacromossomo docariótipo humanoBandas G – se coramcom reagentesespecíficos paraseqüências ricas emAT.
    29. 29. Mapeamento por restriçãoEnzimas nucleases –degradam moléculas deDNA quebrando ligaçõesfosfodiéster que ligam umnuclotideo ao outroExonucleasesEndonucleasesCortam em locaisespecíficos
    30. 30. Mapa de restrição: Cartografia física5’..GTPyPuAC..3’3’..CAPuPyTG..5’5’..AAGCTT..3’3’..TTCGAA..5’
    31. 31. Mapas de vetoresOs vetores são ferramentas utilizadas para introdução emanutenção de uma seqüência de DNA exógeno em um dadohospedeiro.As características mais importantes de um vetor versátil são:Fácil inserção do DNA exógeno a ser clonado, devido àpresença de um polylinker ou poliligante que consiste emuma região vetora que contém vários sítios únicos de cortepara enzimas de restriçãoPresença de genes que atuam como marca de resistência aantibióticosHabilidade de expressar os genes exógenos inseridos nahospedeira e se necessário, apresentar propriedades quefavoreçam a não proliferação ambiental do DNA exógeno
    32. 32. Vetor de clonagem precisa:Replicar em Escherichia coli (E. coli)Ser facilmente separado dos ácidos nucléicos dabactéria e purificadoConter regiões de DNA não essenciais para apropagação em bactériaReceber o DNA exógeno nestas regiões, replicá-lo epropagá-lo como um componente normal do vetorOs plasmídeos possibilitam a clonagem de segmentosde DNA com tamanhos variados, tornando-os vetoresde escolha para diversos procedimentos
    33. 33. Mapa de restrição do plasmídeo pEA1
    34. 34. Clonagem Posicional por mapaA clonagem posicional é o método de encontrar umgene sem nenhum conhecimento da proteína que ocodifica. O primeiro gene humano de doençaidentificado pela clonagem posicional era um para adoença de abscesso crônico.As perturbações em mais de um gene podem causar ofenótipo de CGD, caracterizado pela presença daslesões inflamadas que contêm células imunes aofagócito. Um grupo Boston Childrens Hospital isolou ogene de CGD em Xp21. Os genes para a distrofiamuscular de Duchenne e o retinoblastomaacompanharam rapidamente.
    35. 35. SequenciamentoMarcador molecular Mapa físico Selecção dos clones com mínima sobreposição Clones com minima sobreposição Dividir em subclones (shotgun clones) subclones Sequenciar
    36. 36. Posicionamento dos clones nos Cromossomas 1. Selecção de marcadores STS de vários mapas genéticos ( Exemplo: GeneMap’99, Généthon) 2. Hibridação dos marcadores com as clones da biblioteca BAC por ePCR/FISH 3. Posicionamento de clones BAC no genomaResultado:Integração do Mapa Físico no Mapagenético
    37. 37. Verificando… Posições cromossomais • Ordem dos clones Ordem dos clones era compatível com as As sondas utilizadas foram 96 sobreposições das sequências dos mesmosclones BAC “fingerprinted” • Duplicações e repetições 87 hibridaram apenas com Segmentos duplicados de grandes dimensões (>150Kb)uma banda tem • Gaps geralmente cromossómica grande Nº de bandas que são partilhadas ( >75%) nos seus padrões de restrição • Representatividade do genoma Curtas repetições em tandem (>100 kb) originam clones semelhantes a pequenos insertos e estão presentes em vários clones diferentes (padrão de restrição semelhante) O mapeamento por FISH estava em concordância com as posições Cerca de 96% da sequencia dos #21 atribuídas pelos marcadores STS dos contíguosO mapa Físico de Restrição eclones com base e #22 está representada nos o mapaem STS são coincidentes na ordenação dos clones
    38. 38. centromeric breakpoint MKRN3 (ZNF127) MAGEL2 NDN C15ORF2 SNURF / SNRPNmaternally imprinted HBII-13(genes active only onmale chromosome) HB2-85 HB2- IPW PAR-1 HB2-52paternally imprinted UBE3A-AS(genes active only on UBE3Afemale chromosome) PFATP GABRB3 GABRA5 GABRG3 P HERC2 breakpoint Chromosome 15q11-q13 region telomeric
    39. 39. Mapeado o genoma do fermentoEm maio de 1996, a primeira seqüência completa do genomade um eucarionte - o fermento Saccharomyces cerevisiae - foiobtido.Quando a seqüência do genoma do fermento foi obtida, era omaior genoma sequenciado ate então.Contém quase 12 milhões de pares base empacotados em 16cromossomos.O fermento tem aproximadamente 6.000 genes em tudo.Quase um terço destes genes são relacionados aos geneshumanos; sobreviveram com relativamente pouca alteraçãoatravés de um bilhão anos da evolução que separam os sereshumanos do fermento, sugerindo que realizam funçõesbásicas importantes na vida celular.
    40. 40. Genoma da Escherichia coliEm setembro de 1997, a seqüência completa do genoma daEscherichia coli foi publicada.As bactérias do E. coli vivem na região intestinal mais baixados animais. É uma das muitas bactérias que residem emnossos corpos, normalmente não causando nenhum dano.O genoma do E. coli consiste em aproximadamente 4.600.000pares bases e contém aproximadamente 4.000 genes.
    41. 41. Mapas físicosMapas físicos: é a montagem de trechos contíguos de DNAcromossômico, nos quais a distância entre posições de seqüênciasdefinidas de DNA é expressa de kilobases. O mapa físico final é aseqüência completa.Montagem de mapas físicos:- Alinhamento de clones isolados aleatórios com base em perfis defragmentos de restrição.- Abordagem baseada em hibridizações: uma sonda comum é usadapara identificar quais numa série de clones são provavelmentecontíguos.- Sequenciamento de diferentes fragmentos de DNA e organizaçãodos fragmentos pela análise de superposições (contigs) - Contigs podem ser estendidos pelo sequenciamento daextremidade de clones específicos, levando à identificação de“sequenced-tagged sites” – STSs.
    42. 42. Mapa físico Genoteca de BAC/YACMapa
    43. 43. Mapa físico versus mapa genético
    44. 44. Arroz Humanos
    45. 45. Mapas RNAs ribossomais (rRNAs) são transcritos de conjuntos de arranjos tandem de genes idênticos
    46. 46. Mapeamento do rDNArRNA são polimeros adequados para estudo de diversidadegenéticaSeus genes são universalmente distribuídos entre grupos deorganismosMolécula de maior grau de conservaçãoProporciona analise de filogenia molecular, de acordo com os níveistaxonômicos das espécies, permitindo a separação de espéciesdistintas.São regiões no DNA nuclear de séries repetitivas em tandem, detrês regiões (18S, 5.8S e 28S) e duas regiões espaçadorasintergênicas (ITS e IGS). Os ITS1 e ITS2 são encontrados entre assubunidades: pequena (18S) e grande (28S).
    47. 47. ITS = Espaço Interno Transcrito REGIÕES VARIÁVEISITS-1 ITS 1 ITS 2 18S 5.8S 28S ITS-4 REGIÕES CONSERVADAS
    48. 48. Mapeamento ribossômico (rDNA)Estrutura do cluster gênico que codifica para rRNA.As setas indicam as regiões franqueadas pelos iniciadores ITS1 e ITS2
    49. 49. rDNAOutra porção do DNA repetitivo encontrado no nuDNARepresenta uma das maiores famílias de sequenciasrepetitivas n eucarioticosConstituída de três genes: 18S, 5.8S e 26 SEstas unidades estão associadas às regiões organizadorasdo nucléolo (NORs)NORs: porções de fibras cromatínicas ondee estão osgenes que codificam os rRNAsO número de NORs varia de espécie para espécie –hibridização in situ – não reflete o número de nucléolos
    50. 50. O tamanho da unidade ribossomal, com espaços intergênicos, varia de 7,8kb a 18,5 kb, com numero de cópias que pode variar de 600 a 8500 porgenoma haplóide A unidade ribossomal é constituída pelos genes 18S, 5,8S e 28S e dos espaçadores transcritos internos (ITS) que intercalam os genes. A sigla IGS indica o espaço intergênico, o qual separa as unidades ribossomaisOs genes do RNA ribossomal 5s (5S rDNA) – varia de 140 a 900pb, cadaunidade de repetição pode variar de 1 mil a 50 mil cópias por genomahaplóideO gene 5S é altamente conservado em seqüências e tamanho ≈ 120pbEm plantas as seqüências ITS variam em comprimento de ≈ 500-700pb emangiospermas e 1500-3700pb em algumas gimnospermas
    51. 51. Fluorescência nos sítios de rDNA em três espécies de arrozrgp.dna.affrc.go.jp/.../ nl4.html
    52. 52. Mapeamento por FISHHibridização in Situ (HIS) é um método empregado para avisualização de seqüências definidas de ácidos nucléicos, empreparações celulares, através da hibridação de seqüênciascomplementares (sondas).“In situ” significa “no local original” em LatinEnvolve uma sonda de ácido nucleico marcada com um sequenciade DNA ou RNA hibridizando com DNA ou RNA in situ (nas células)Localização da sequencia de interesse – célula, tecido oucromossomoUsada no mapeamento de genomas de plantas, na detecção deseqüências únicas e, principalmente, de seqüências de DNArepetitivo.
    53. 53. O cromossomo metafásico típico éformado por duas cromátides irmãs,uma delas oriunda do processo deduplicação da cromatina.Esse método, descrito por Pardue eGall (1969), permite a detecção deseqüências específicas emcromossomos metafásicos, bemcomo em núcleos interfásicos. Atécnica proporciona a interaçãoentre conhecimento da biologiacelular, citogenética clássica egenética molecular e
    54. 54. Princípio do método:Durante a divisão celular, os cromonemasespiralizam-se, tornando-se mais curtos emais grossos. Podem, então, ser vistosindividualmente e passam a ser chamadosde cromossomos, este está relacionado comcromossomos mitóticos metafásicosO material genético descondensado –cromatina - é ativo, pois pode ser transcritomais facilmente nesse estado .
    55. 55. VisualizaçãoMicroscopia óptica – mais comum, usados para sondas marcadasradiativamente ou marcados com peroxidase ou fosfatase alcalinaMicroscópio Fluorescence – sondas marcadas com fluorescencia, luz UV excitaa fluorescência FISH (do inglês, fluorescent in situ hibridization) Identificação especifica em dois cromossomos: • cromossomo 2 marcado com green • cromossomo 4 marcado com orange.
    56. 56. Aplicações1. Obtenção de mapas físicos, funcional e estrutural do genoma2. Determinar a distribuição e posição de material cromossomo extra- especifico3. Determinar a existência de pareamento e recombinação intergenômica4. Determinar a existência de segregação preferencial (responsável pela herança não mendeliana de alguns tipos de cromossomos)5. Determinar a presença e tipo de rearranjos cromossômicos
    57. 57. Hibridização comparativa genômica GISH (Genomic in situ hibridization)DNA total genômico marcadas com DNA total genômico marcadas com biotina de células para análise biotina de células normais (DNA (DNA teste) controle) marcado com digoxigenina Co-hibridização A partir do Resulta em sinal normal do cromossomo (cariótipo DNA: parcial) Sinais a partir Dna teste Sinais a partir da co-hibridização hibridizado do DNA controle
    58. 58. Mapeamento de OrganelasMitocônndria e cloroplastos possuem genomas que nãoapresentam herança Mendeliana.Genomas de organelas realizam segregação somática emplantasGenomas de organelas são DNAs circulares que codificam asproteínas das organelasFormado, geralmente, por moléculas circulares de DNAuma organela apresenta várias cópias de seu genomaGenomas de cloroplastos são relativamente grandesComparações de DNA mitocondrial sugere que os sereshumanos descendem de uma única fêmea que viveu a 200.000anos na África
    59. 59. Mapeamento Mitocondrial
    60. 60. mitocondrias mostram tamanhos variados de genoma  o número de genes codificadores de proteínas é pequeno  a maior parte é codificadora de componentes das subunidades dos complexos da respiração I-IV  genes codificadores de RNAGenoma mitocondrial apresenta introns, exceto nosmamíferos
    61. 61. Organização do DNA mitocondrial•DNA mitocondrial de célulasanimais é compacto e codifica 13proteínas, 2 rRNAs e 22 tRNAs•não há introns•alguns genes se sobrepõem asproteínas•estão envolvidas na respiração•mtDNA de levedura é 5x maiordo que o animal devido àpresença de longos introns•ocorre maior dispersão de loci
    62. 62. Genoma VegetalOs vegetais são constituídos de três genomas: genomasGenoma nuclear – 90%Genoma plastidial ou cloroplasmático - 5%Genoma mitocondrial – 1%
    63. 63. Organização do genoma mitocondrial:• mtDNAs ocorrem em todas as células eucaróticas aeróbicas e gera energia para produzir ATP pela fosforilização oxidativa• A maioria dos genomas mtDNA genomes são circulares (mtDNAs ocorre em alguns protozoarios e alguns fungos).• Em algumas espécies a %GC é alta, de facil separaçao do mtDNA puro a partir do DNA nuclear por gradiente centrifugação.• Multiplos genomas por mitocondrias e muitas mitocondrias por celulas (facil isolamento por PCR).• Tamanho do genoma de mtDNA varia: • Humanos e outros vertebrados ~16 kb (todo o mtDNA codifica produtos gênicos) • Leveduras ~80 kb • Plantas ~100 kb to 2 Mb (perdas de mtDNA não codificante)
    64. 64. Marchantia polymorpha – 121Kb136 genes: 4 rRNA, 29tRNA90 genes codificadores deproteínas - destes 20 estãoenvolvidas no transporte deelétrons durante a fotossíntese
    65. 65. Genoma nuclearParadoxo do valor C (DNA haplóide) = pares de baseNão existe correlação entre o tamanho do nuDNA e onúmero de genesAngiospermas – 80% do nuDNA é DNA repetitivoCorrelação positiva entre a quantidade de seqüências deDNA repetitiva em um genoma e sua quantidade de DNA
    66. 66. O tamanho do DNA nuclearPlantas superiores - 1,1 x 106 pb a 1,1 x 1011pbAngiospermas – 3 x 108 a 1 x 1011pbOcorre um incremento na escala evolutivaRNA associado a cromatina (RNA nascentes, presos a fita molde)representa 3% de sua composiçãoOs genomas nucleares das angiospermas encontram-se entre os maioresconhecidos.O genoma nuclear de Arabidopsis thaliana tem 125Mb que compreendem25.498 gens.Do arroz (Oryza sativa) tem se seqüenciado duas variedades e seugenoma é quase 4 vezes maior que o de A. thaliana e compreendem de32.000 a 55.615 genes.Para o milho (Zea mays), embora não seqüenciado, se conhece muitainformação estima-se que 60 a 80% de seu genoma nuclear estaconstituído por elementos móveis
    67. 67. Organização do genoma nuclear
    68. 68. Genoma do cloroplastoCodifica várias proteínas e RNAsCloroplastos apresentam DNA com tamanho variado:120-190 kbCodifica todos os rRNAs e tRNAs necessários para a sínteseprotéica, e aproximadamente 50 proteínasOs genes da organela podem ser transcritos e traduzidospelo aparato da mesma
    69. 69. O genoma cloroplasto Sequencia no genoma varia de 70kb - 201kb Variação no comprimetno principalmente a presença de reperições invertidas (RI) 100-250 genes:  Gene expressos  Fotossíntese – 20 genes  Metabolismo
    70. 70. Genes perdidos na evolução dos cloroplastos Zea (75) 5 (2) 1 (0) Oryza (75) 45 genes presentes 4 (0) Nicotiana (76) em todos os genomas 7 (5) 12 (0) Pinus (69) Confirmação que 129 (34) 1 (0) Marchantia (84) genoma dos 34 (9) 14 (14) Euglena (58) plastideos ancestral 1 (0)Ancestralplastidio 20 (1) 77 (0) Porphyra (200) foi altamente reduzido Odontella (124) (( 235) 99 (3) das cianobacterias Cyanophora (136)
    71. 71. Genes do cloroplasto Land Plants Algae Photosyn. Epifagus Euglena Others PorphyraTotal 101-107 40 82 113-166 181Gene expression rRNA 4 4 3 3 3 tRNA 30-32 17 27 28-36 35 r-protein 2-21 15 21 21-44 47 Other 5-6 2 4 6-9 18Photosynthesis RuBisCo/thylakoid 29-30 - 26 31-48 53 ndh 11 - - -/10 -Metabolism/misc. 1-5 2 1 7-14 25Introns 18-21 6 149+ -/1/3 -
    72. 72. Conteúdo de tRNA no genomamitocondrial em diferentes espécies
    73. 73. Plantas Modelos para estudos genômicos • Arabidiopsis thaliana --model flowering plant and dicot • Oryza sativa (rice) --model monocot • Medicago truncatula (barrel medic) --model legume • Lycopersicon esculentum (tomato) --model fruit-bearing plant Also maize, tobacco, Chlamydomonas, wheat, etc.…
    74. 74. Arabidopsis thaliana Modelo de genoma em plantasA. thaliana é membro da familia dasBrassicaceae (mostardas) .Genoma: 125 Mb (muito pequeno parauma planta).Trigo: 16,5 Gb, Soja: 5 Gb.Cromossomas: 5Genes: 25.498 (comparável ao humano)Website: http://www.arabidopsis.org

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