Eletroforese

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Eletroforese

  1. 1. ELETROFORESE Prof. Dra. Adriana Dantas UERGS Bento Gonçalves, RS
  2. 2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS Introduzida por Tiselius em 1937, foiinicialmente realizada em meio líquido, sendoposteriormente aperfeiçoada com emprego deum meio-suporte. É uma técnica bioquímica versátil,relativamente simples, rápida e de grande poderinformativo, tornando-se indispensável nas maisdiversas áreas da biologia molecular. Atualmente é aplicada na análise de enzimas,proteínas e ácidos nucléicos e tem amplamenteusada em estudos de taxonomia, bioquímica,fisiologia e genética humana, de plantas, animaise microrganismos.
  3. 3. POTENCIAL DE USO Identificação de fungos, bactérias, nematóides, vírus, viróides; Caracterização de fitopatógenos; Estudos de genética e evolução de fungos fitopatogênicos; Identificação de clones, cultivares e linhagens; Estudos citogenéticos, ecológicos, fisiológicos e bioquímicos; Estudos de resistência à doenças;
  4. 4. POTENCIAL DE USO Estudos da relação patógeno-hospedeiro; Determinação do peso molecular de proteínas; Caracterização de moléculas de ácidos nucléicos; DNA recombinante, seqüênciamento de nucleotídeos; Mapeamento de fragmentos de restrição; Amplificação de DNA.
  5. 5. PRÍNCIPIOS DA TÉCNICA DE ELETROFORESE A eletroforese consiste na migração demoléculas ionizadas, de acordo com suas cargaselétricas e pesos moleculares em campo elétrico. Moléculas com cargas negativas migram parao pólo positivo (ânodo) e moléculas com cargapositivas migram para o pólo negativo (cátodo). Em razão das proteínas serem substânciasanfóteras, é indispensável manter constante o pHdo meio durante a eletroforese, através do uso desoluções-tampão para não gerar cargas, as quaispodem interferir na corrida.
  6. 6. Ferramentas da Biologia MolecularEnzima de restrição PCR Eletroforese Termociclador DNA ligase CA AR L S CO AR CAS COL
  7. 7. A separação dos fragmentos damolécula de DNA em gel deeletroforeseCaracterísticas do DNASeparação por tamanho
  8. 8. Eletroforese (Michaelis, 1909)GéisAmido —AgaroseAcrilamidaSoluções-tampões + O sentido e a velocidade de migração é determinado pelo tamanho e carga das moléculas
  9. 9. O princípio básico envolvido na obtenção edetecção de cada classe de marcadorbioquímico ou de DNA reside no uso deeletroforese.O termo eletroforese foi criado por Michaelisem 1909, para descrever migração decolóides sob a influência de um campoelétrico.Seu princípio é simples: moléculas de carganegativa migram para o pólo positivo, emoléculas com carga positiva migram para opólo negativo. A eletroforese visa à separação demoléculas em função de suas cargaselétricas, de seus pesos moleculares ede suas conformações, em suportesporosos (géis) e soluções-tampões(estabilizam o pH do meio e permitem o fluxode corrente elétrica).
  10. 10. AGAROSE
  11. 11. Carregando o gel com asamostras
  12. 12. Revelando gel de agarose em U.V. – brometo de etídeo
  13. 13. Análise DNA forenseExemplo, de caso resolvido pelo gelvertical de acrilamida corado com nitratode prataSangue retirado de chapéu e jeansS = suspeitoV- vítima
  14. 14. SISTEMA TAMPÃO  Tampão usado na preparação do gel;  Tampão do tanque ou cuba eletrolítica;CONDUÇÃO DA ELETROFORESE Gradiente de densidade Meios de suporte: * Papel filtro; * Sílica gel; * Membranas de acetato de celulose; * Amido; * Gel de agarose; * Poliacrilamida.
  15. 15. CORRENTE ELÉTRICA: A passagem da corrente elétrica através de uma solução segue a lei de Ohm, na qual: V=R.I V = voltagem, R = resistência e I = amperagemPara que a técnica funcione, deve ser desenvolvida sobvoltagem (V), corrente (I) e potência (W) constantes. VELOCIDADE DE MIGRAÇÃO:* Diretamente proporcional: ao campo elétrico e à cargalíquida.* Inversamente proporcional: ao raio, à distância entre osdois eletrodos e à viscosidade.
  16. 16. TEMPERATURA: Quanto mais elevada a voltagem ou aintensidade da corrente, maior será o aumentode temperatura. No caso de eletroforese de isoenzimas e deproteínas, as temperaturas elevadas podemdegradar as enzimas e proteínas, o que,eventualmente, resulta na perda da atividadeenzimática e protéica.
  17. 17. VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS: PROTEÍNAS: corante “coomasie blue” ENZIMAS: solução específica (substrato,coenzimas, solução-tampão e sais) DNA e RNA: vários sistemas de revelação, taiscomo: - Fluorescência (Brometo de Etídio); - Radioatividade; - Nitrato de prata;
  18. 18. SISTEMA DE RESOLUÇÃO AFLP RAPD AgaroseBrometo de Etídeo U.V. Poliacilamida Nitrato de Prata 0,2%
  19. 19. SISTEMAS DE ELETROFORESE: POSIÇÃO DO GEL: vertical ou horizontal; POROSIDADE: contínuo ou descontínuo; PASSAGEM DA CORRENTE: unidirecionalou bidirecional.
  20. 20. APLICAÇÕES EM ANÁLISE ENZIMÁTICA: As isoenzimas são empregadas comomarcadores genéticos, e suas aplicações vãodesde a genética de microrganismos até agenética humana. Isoenzimas são usadas para reconstruçãoda história evolutiva das espécies, e comoferramenta taxonômica capaz de caracterizarvariantes individuais de uma dada espécie,apresentando valia na sistemática de raças,espécies e gêneros estreitamente relacionados.
  21. 21. APLICAÇÕES EM ANÁLISE ENZIMÁTICA: Análises eletroforéticas em plantas eanimais mostram que padrões de isoenzimase a intensidade relativa dos eletromorfos sãoespécie-específica para órgãos ou tecidos epara estádios de desenvolvimento. O estádio de desenvolvimento em que asisoenzimas aparecem ou desaparecemrefletem a ativação ou repressão de genes quecontrolam a síntese das enzimas.
  22. 22. Eletroforese de isoenzimas* Isoenzimas - diferentes formas moleculares (variantes) deuma mesma enzima, apresentando função idêntica ousimilar, presente num mesmo indivíduo (Markert & Moller,1959). 6PGDH -CM Gel de Araucaria angustifolia MANTOVANI, 2003
  23. 23. monomérica alelo 1 alelo 2 alelo 3Resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas MANTOVANI, 2003
  24. 24. APLICAÇÕES EM ANÁLISE PROTÉICAS: A grande maioria das análises protéicas érealizada pelo sistema denominado SDS-PAGE, na qual se usa o detergente DodecilSulfato De Sódio (“Sodium Dodecyl Sulfate”). Basicamente, a proteína é desnaturadapor aquecimento na presença de 2-mercaptoetanol, que rompe as ligaçõesdissulfeto, e os polipetídeos adquirem a carganegativa do SDS. A separação no gel dá-seunicamente pela diferença dos pesosmoleculares.
  25. 25. APLICAÇÕES EM ANÁLISE DE DNA E RNA: A migração eletroforética de ácidos nucléicos éamplamente empregada em técnicas de biologiamolecular, para separar, isolar e manipular fragmentosde DNA e RNA. O sentido da migração dos ácidos nucléicos ésempre em direção ao ânodo ou pólo positivo, poispossuem carga total negativa decorrente de seusgrupamentos fosfato. Além disso, em presença de tampões adequados,que permitem a desnaturação das conformaçõessecundárias ou terciárias, fragmentos linearespequenos, bem como fitas simples, migram maisrapidamente do que os longos e de fita dupla.
  26. 26. APLICAÇÕES EM ANÁLISE DE DNA E RNA: Técnicas eletroforéticas usadas nasseparação de fragmentos de DNA/RNA: DGGE - Eletroforese em Gel com GradienteDesnaturante: emprega gradientes desnaturantesquímicos. TGGE – Eletroforese em Gel com Gradiente deTemperatura: refere-se a gradientes detemperatura. PFGE/IFGE – Eletroforese em Gel com Campoem Pulso/Inverso: refere-se a gradienteselétricos.
  27. 27. GEL DE AGAROSE
  28. 28. GEL DE POLIACRILAMIDA
  29. 29. Gel acrilamida
  30. 30. GEL DE PROTEÍNA
  31. 31. Picture 5
  32. 32. Gel de Proteína - Gluteninas

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