- Evaluation de l’activité bactéricide et bactériostatique des huiles essentielles vis-vis des souches d’origine clinique résistantes aux antibiotiques.
- Congrès Francophone de Phytothérapie: "Place de la phytothérapie dans les systèmes de Santé". Beyrouth 25 juin 2010
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LA POLYARTHRITE RHUMATOIDE, UNE AMELIORATION DE LA PRISE EN CHARGE AVEC NOTAM...
Evaluation de l’activité bactéricide et bactériostatique des huiles essentielles vis-vis des souches d’origine clinique résistantes aux antibiotiques
1. Evaluation de l’activité bactéricide et
bactériostatique des huiles essentielles
vis-vis des souches d’origine clinique
résistantes aux antibiotiques
Dr Abdesselam Zhiri
Directeur de recherche, Pranarôm International, Belgique
Chercheur, Université Libre de Bruxelles, Belgique
Collaborateur Universitaire, Belgique-France-Espagne-Maroc
Congrès Francophone de Phytothérapie
"Place de la phytothérapie dans les systèmes de
Santé"
Beyrouth 25 juin 2010
3. Introduction
Usage excessif
La résistance des bactéries aux antibiotiques: Raison urgente d’agir ?
13.288 tonnes d’antibiotiques ont été
consommées dans l’union européenne et en
Suisse en 1999, dont 65% en médecine
humaine, 29% en usage vétérinaire et 6% en
tant que promoteurs de croissance.
De leur côté, les Etats Unis ont produit 16.200
tonnes d’antibiotiques en l’an 2000, dont plus
des 2/3 étaient destinés à l’élevage…
La France figure parmi les pays les plus
utilisateurs des antibiotiques. Environ 100
millions de prescriptions d’antibiotiques par an
(premier rang européen)
En 2005, les ventes en ville d’antibiotiques
s’élevaient à 662,6 millions de doses définies
journalières ‘DDJ’, soit 29 doses pour 1000
habitants par jour
4. Introduction
Usage désordonné
La résistance des bactéries aux antibiotiques: Raison urgente d’agir ?
30% des 100 millions de prescriptions
d’antibiotiques, en France, sont inappropriées. Elles
sont destinées à traiter des infections virales,
essentiellement respiratoires et ORL.
Les jeunes enfants de 0 à 6 ans sont les plus gros
consommateurs d’antibiotiques
5. Introduction La résistance des bactéries aux antibiotiques: Raison urgente d’agir ?
Maladies nosocomiales
En France, au cours de la dernière
enquête nationale sur les infections
nosocomiales conduite en juin 2006, le
SARM était la bactérie multirésistante
la plus fréquemment isolée d’infections
nosocomiales (9,4%), devant les
entérobactéries résistantes aux
céphalosporines de 3ème génération
(5,3%) et les Pseudomonas aeruginosa
résistants à la ceftazidime (2,4%)*.
*Réseau d’alerte, d’investigation et de surveillance des infections
nosocomiales (Raisin). Enquête nationale de prévalence 2006,
résultats. http://www.invs.sante.fr/enp2006
Augmentation de la consommation
Résistance augmente
SPIRALE de la RESISTANCE
Conséquences
6. Objectifs
Screening des huiles essentielles présentant des propriétés antibactériennes
Activité Bactériostatique
Activité Bactéricide
Montrer les opportunités des HECT dans le domaine de l’infectiologie
Evaluation de cette activité vis-à-vis des souches ayant des degrés divers de
résistance aux antibiotiques
Souches bactériennes, ATCC
Souches cliniques phénotypées et génotypées
Etudes de mode d’action antibactérienne des HE
Microscopie Electronique à Balayage (MEB)
Microscope électronique à transmission
Etudes biochimiques
Etudes de la résistance bactérienne aux HE (Recherche de mutants)
‘PAP’ Profils d’Analyse de Populations
‘PS’ Pression de sélection
7. Une substance bactéricide est une substance possédant la capacité de
tuer des bactéries
La concentration minimale inhibitrice (CMI) est la concentration minimale
d'un antibiotique qui permet d'inhiber le développement d'une colonie
bactérienne
Généralités & définitions:
La concentration minimale bactéricide (CMB) est la quantité minimale
d'antibiotiques suffisante pour ne laisser survivent qu'une bactérie sur
10000 et ceci en 24 heures à 37 °C.
Une substance bactériostatique est une substance permettant de
suspendre la multiplication des bactéries; ce qui aboutit au vieillissement
de celles-ci voire leur mort
Les antibiotiques bactériostatiques inhibent la croissance et la reproduction
des bactéries, mais ne les tuent pas, alors que les antibiotiques bactéricides
tuent les bactéries.
8. Définition d’une huile essentielleDéfinition d’une huile essentielle
Une huile essentielle (HE): Produit odorant, non soluble dans l’eau, composé de 10 à
150 molécules chimiques aromatiques et volatiles. Elle est obtenue par
distillation à l’eau ou à la vapeur d’eau de végétaux ou parties de végétaux.
(AFNOR)
Une huile essentielle chémotypée (HECT): est une HE définie botaniquement et
biochimiquement
Généralités & définitions:
1 litre d’huile essentielle peut être obtenu après distillation de :
7 kg de clou de girofle (Eugenia caryophyllus)
50 kg de lavandin (Lavandula hybrida super)
150 kg de lavande vraie (Lavandula angustifolia)
4000 kg de pétales de rose de Damas (Rosa damascena)
jusqu’à 10.000 kg de mélisse (Melissa officinalis)
9. Généralités & définitions:
- Définie par son espèce botanique, son organe distillé, sa provenance géographique
EXEMPLE : HECT d’ORIGAN
FICHE D'ANALYSE – ANALYSIS SHEET
Nom botanique – botanical name : Origanum compactum
Nom commun – french name : ORIGAN COMPACT
Numéro du lot – lot number : OCSFPH0305
Origine - origin : PRANAROM - MAROC
Partie de la plante- part of the plant: SOMMITÉ FLEURIE
Date de distillation – distillation date : 06/2004
Date de peremption – out of date : 03/2010
QUALITE (1/2)
-
HECT 100% Pure, Intégrale et Naturelle
10. Généralités & définitions:
Profil CHROMATOGRAPHIQUE
20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
Time-->
Abundance
TIC: OCPH0904.D
Aspect - physical state Liquide limpide
Couleur - colour
Jaune doré
Odeur - odour
Phénolique, épicée
Densité à 20°C - density
0,921
Densité à 15°C - density 0,925
Indice de réfraction à 20°C
- refractive index 1,501 0
Pouvoir rotatoire à 20°C -
optical rotation + 0,5 °
Miscibilité à l’éthanol à
80% - miscibility
1,6 vol. d’alcool / 1
vol. d’H.E
Point d’éclair: -flashpoint 56 °C
- Définie par sa spécificité biochimique
appelée chémotype et contrôlée par CPG-SM
QUALITE (2/2)
- Contrôlée par des analyses
Physico-chimiques
12. Souches ATCC
et souches
cliniques
Souches
bactériennes
Gram- et
Gram+
Souchothèque
Matériels & Méthodes
Souches
génotypées
et phénotypées
Haut niveau de
résistance aux
antibiotiques
Souchothèque variée
- Entérobactéries
avec pénicillinases et
céphalosporinases
- Entérocoques van A, van B, van C
- Staphylococcus aureus
résistants à la méticilline, GISA, hétéroGISA
- Stenotrophomonas maltophilia
- Acinetobacter baumanii
avec imipénémase ou βLSE
- Pseudomonas aeruginosa avec βLSE
- Pasteurella multocida
- Bordetella bronchisepta
- Branhamella catarrhalis
- Listeria monocytogenes
- Vibrio cholerae
- …
13. Matériels & Méthodes
Schéma de la technique de diffusion en puits
Séchage à 37°C pendant 2h
MHA (1.5%) agar
Des cylindres creux sont déposés sur la gélose
La surcouche (LB à 0.8% d ’agar inoculé par la souche
bactérienne à une densité de 106
UFC/ml)
en surfusion à 45°C
Résultats: mesure du diamètre de la zone d ’inhibition
Enlèvement des cylindres
Remplissage des puits par 50 µl de l ’huile essentielle
Concentration d’HE inhibitrice
=
concentration minimale pour laquelle une zone d’inhibition était visible
après 24 heures d’incubation à 37°C
Zone d’inhibition de croissance
14. Matériels & Méthodes
Technique de dilution en gélose
- dilution de l’HE de 2 en 2 dans une solution d’agar 0,15 %
- préparation de 11 géloses contenant différentes concentrations d’HE
(0,01 % à 10 % v/v) et d’une gélose témoin sans HE
- inoculation de l’inoculum bactérien en spot de 105
UFC
TECHNIQUE STANDARDISEE POUR L’EVALUATION DES ANTIBIOTIQUES
Concentration Minimale Inhibitrice (CMI)
=
concentration minimale entraînant une inhibition de croissance bactérienne
après 48 heures d’incubation à 37°C
CMI = 0,62 %CMI = 0,31 % d’HE
15. Matériels & Méthodes
Technique de diffusion en milieu liquide
Contrôle négatif
(sans huile essentielle)
Contrôle positif
(sans huile essentielle)
Séries de dilutions doubles de l ’huile essentielle d ’Origanum compactum
1% 0.0039%
Inoculation par la culture bactérienne (densité finale d’environ 106
UFC/ml)
Incubation à 37°C pendant 18hIncubation à 4°C pendant 18h
50 µl de la résazurine
Incubation à 37°C pendant 2h
Résazurine oxydée Résazurine réduiteCMI
16. Matériels & Méthodes
Cinétique de bactéricidie (Time Killing Curve)
1 mL d’une dilution d’HE dans une solution d’agar 0,15%
+
9 mL milieu de croissance contenant un inoculum de
107
UFC/mL bouillon
10-1
10-2
10-4
10-5
10-3
37°C sous agitation
Dilutions de 10 en 10 dans 4,5 mL d’eau à des temps
déterminés (5mn, 15mn, 30mn, 1h, 2h, 4h, 6h, 24h, 48h)
Repiquage de chaque dilution (100 µL) sur gélose
Dénombrement bactérien
37°C pendant 18h
bactéricidie
=
chute de 5 log de l’inoculum initial
(réduction de 99,999%) en moins d’une heure
17. Cannelle
écorce
Origan Ajowan Thym Girofle
Cannelle
feuille
Lemon
grass
Tea tree
n (Gram+ et Gram-) 62 62 62 61 62 62 57 62
CMI 90% 0,16 0,31 0,46 0,62 0,62 1,25 1,25 1,88
n (Gram +) 35 35 35 34 35 35 30 35
CMI 90% 0,16 0,31 0,46 0,94 0,62 1,25 0,62 1,88
n (Gram -) 27 27 27 27 27 27 27 27
CMI 90% 0,12 0,23 0,31 0,46 0,62 0,62 1,25 0,94
n (P. aeruginosa) 2 2 2 2 2 2 2 2
Ecart de CMI 0,16-0,31 1,88-2,5 7,5-10 >10 10->10 10->10 10->10 10->10
Activité bactériostatique
(dilution en gélose)
Palmarosa Eucalyptus Cajeput Lavande Orange
n (Gram+ et Gram-) 62 60 59 62 59
CMI 90% 10 7,5 10 >10 >10
n (Gram +) 35 33 32 35 32
CMI 90% 0,31 7,5 7,5 5 >10
n (Gram -) 27 27 27 27 27
CMI 90% 10 10 7,5 >10 >10
n (P. aeruginosa) 2 2 2 2 2
Ecart des CMI >10 >10 10->10 >10 >10
CMI (% v/v) des 13 HE sur les 64 bactéries Gram +, Gram – et P. aeruginosa
CMI > 2 % v/v
HE les - actives
CMI < 2 % v/v
HE les + actives
Résultats & Discussion
22. CINETIQUE DE BACTERICIDIE DE LA CANNELLE ECORCE
SUR Staphylococcus aureus 43300
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Time
LogUFC/mL
growth control
10%
5%
2,5%
1,25%
0,62%
0,31%
0,16%
0,08%
0,04%15
mn
30
mn
60
mn
2h 4h 6h 24h 48h5
mn
Activité bactéricide
résultats (1/3)
diminution de 5 log
Résultats & Discussion
23. CMI (% v/v) 0,12 0,23 0,31 0,46 0,94
05 mn >10 0,62 >10 1,25 >10
15 mn 2,5 0,62 2,5 1,25 >10
30 mn 1,25 0,62 0,62 1,25 >10
60 mn 0,62 0,62 0,62 1,25 10
24 h 0,16 0,62 0,62 1,25 2,5
CMI (% v/v) 0,04 0,16
05 mn >10 1,25
15 mn >10 1,25
30 mn >10 0,62
60 mn 2,5 0,62
24 h 0,31 0,62
/ non déterminé
TEA TREE
S.aureus
S.pyogenes
CANNELLE
ECORCE
ORIGAN THYM
CANNELLE
FEUILLE
// /
Concentrations bactéricides (% v/v) des HE sur les Gram+
S. aureus et S. pyogenes
CMB (concentration minimale bactéricide dans le temps le plus bref en moins d’ une heure)
Activité bactéricide
résultats (2/3)
bactéricidie
temps
dépendante
Résultats & Discussion
24. CMI (% v/v) 0,08 0,23 0,31 0,46 0,62
05 mn 0,62 0,31 0,31 1,25 1,25
15 mn 0,62 0,31 0,31 1,25 1,25
30 mn 0,31 0,31 0,31 1,25 1,25
60 mn 0,31 0,31 0,31 1,25 1,25
24 h 0,08 0,31 0,31 1,25 1,25
CMI (% v/v) 0,16 2,5 >10 >10 >10
05 mn 0,62 1,25 >10 / >10
15 mn 0,62 1,25 >10 / >10
30 mn 0,62 1,25 >10 5 >10
60 mn 0,62 1,25 >10 5 >10
24 h 0,31 * >10 * *
TEA TREE
CANNELLE
FEUILLE
* manque de reproductibilité
/ non déterminé
CANNELLE
ECORCE
ORIGAN THYM
E.coli
P.aeruginosa
Activité bactéricide
résultats (3/3)
bactéricidie totale
CMB (concentration minimale bactéricide dans le temps le plus bref
Concentrations bactéricides (% v/v) des HE sur les Gram-
E. coli et P. aeruginosa
chute de 4 à 5 log
quelle que soit
la concentration ≥ 1,25%
Résultats & Discussion
25. Recherche de mutants
Résultats & Discussion
Existe-t-il des mutants résistants aux HE
dans une population bactérienne de 1011
UFC/mL ?
2 méthodes
Pression de sélection
=
Méthode « dynamique » de sélection
Profils d’Analyse de Populations
(PAP)
=
Méthode « statique » de détection
technique classiquement
utilisée pour la détection
des staphylocoques dorés
GISA et hétéroGISA
26. Recherche de mutants
Résultats & Discussion
CMI
(% v/v)
concentrations
d'HE (% v/v)
nb de colonies
(UFC/mL)
mutants
résistants
0,16
Témoin 4.1010
NON
0,04 6.107
0,08 1.107
0,16 0
0,31 0
0,62 0
Suspicion de mutants
=
croissance bactérienne sur les milieux gélosés contenant des concentrations
d’HE supérieures à la CMI
CMI
(% v/v)
concentrations
d'HE (% v/v)
nb de colonies
(UFC/mL)
mutants
résistants
0,16
Témoin 4.1010
OUI ?
0,04 6.107
0,08 1.107
0,16 +
0,31 +
0,62 +
Comparaison des CMI
des colonies suspectes
et des CMI des colonies témoin
Pour les 5 HE testées en bactéricidie,
absence de mutants résistants
pour E. coli, S. aureus et P. aeruginosa
Profils d’Analyse de Populations (PAP)
27. Recherche de mutants
Résultats & Discussion
PRESSION DE SELECTION (PS)
sélection de mutants résistants avec des
concentrations croissantes d’HE subbactéricides
ABSENCE DE MUTANTS
CMI des bactéries survivantes
=
CMI souche témoin
Pression de sélection sur P. aeruginosa
en présence de Cannelle écorce
Jours
concentrations d'HE
(% v/v)
survie bactérienne
J1 0,16 oui
J2 0,31 oui
J3 0,31 oui
J4 0,46 oui
J5-J8 0,62 oui
J9 0,94 oui
J10 1,25 non
J11 1,88 non
28. Résultats & Discussion
Témoin S. pyogenes
G 15000
S. pyogenes
G 15000
Cannelle écorce
0,62%
pendant 15 min
Témoin S. aureus
G 10000
S. aureus
G 9000
Cannelle écorce
2,5% (v/v)
pendant 15 min
Photographies prises par I. Anselme-Bertrand, CMES – Faculté de Médecine de Saint Etienne
Mode d’action antibactérienne des HE: Microscopie Electronique à Balayage (MEB)
29. Résultats & Discussion
Mode d’action antibactérienne des HE: Microscopie Electronique à Balayage (MEB)
Témoin E. coli
G 10000
E. coli
G 8000
Cannelle écorce
1,25% (v/v)
pendant 05 min
Photographies prises par I. Anselme-Bertrand, CMES – Faculté de Médecine de Saint Etienne
30. Staph. aureus Ps. aeruginosa
Contrôle
HE
d’O. compactum
HE
de C. verum
mésosomes
vésicules
coagulations
coagulations
Changements ultrastructuraux
Résultats & Discussion Microscope électronique à transmission
31. 1.Réduction de la viabilité
2.Perte de la perméabilité membranaire
3.Dissipation potentiel membranaire
4.Changements ultrastructuraux
HECT de C. VerumHECT d’O. compactum
Résultats & Discussion
32. Conclusions
C. Verum la plus active contre Ps. aeruginosa.
O. Compactum exprime une grande activité contre les autres souches.
Ces deux HE montrent également un fort pouvoir antifongique.
Meilleure activité antibactérienne HE riches en phénols ou en
aldéhydes (carvacrol et/ou en thymol ou en cinnamaldéhyde).
Gram + plus sensibles que les Gram –
33. Suite à cette présentation des résultats et
à travers toute la richesse bibliographique
dans le domaine, nous pensons qu’il est temps
de parier suffisamment sur l'opportunité
qu'offriraient les huiles essentielles dans le
domaine de microbiologie et dans les
traitements et les préventions microbiennes.
Conclusion générale
Nous mettons à votre disposition, sur simple demande par mail, des copies de nos
publications sur ce sujet. Web: www.pranarom.com Mail: azhiri@pranarom.com
34. Perfectionner ces tests et les adapter aux HE
Pratiquer des confirmations comparatives
Perspectives
Evaluer l’activité in vitro et in vivo des huiles et des synergies
Chercher les éléments responsables de ces activités
Purification & détermination de la structure des molécules
‘actives’ issues de ces fractions
Exploitation des HECT et des molécules antimicrobiennes dans le
domaine pharmaceutique et en médecine naturelle
Techniques de fractionnement ‘chromatographies CCM, CG, HPLC’
Nous mettons à votre disposition, sur simple demande par mail, des copies de nos
publications sur ce sujet. Web: www.pranarom.com Mail: azhiri@pranarom.com
35. Partenaires & collaborateurs :
Direction Générale des Technologies, de la Recherche
et de l’Energie. La Région Wallonne de Belgique
Dr Jamal Abrini & Dr Samira Bouhdid
Département de Biologie, Unité de Biologie Cellulaire et Moléculaire
(BCM), Université Abd Elmalek Essaadi, Tétouan, Morocco
Dr Gérald Aubert & Dr Laurence
Laboratoire de Bactériologie, CHU Hôpital Bellevue, Saint-Etienne,
France
Dominique Baudoux, Pharmacien
S.A. PRANAROM International, Ghislenghien, Belgium.
Nous mettons à votre disposition, sur simple demande par mail, des copies de nos
publications sur ce sujet. Web: www.pranarom.com Mail: azhiri@pranarom.com
36. Merci beaucoup
Votre attention
est méritoire
Vos réflexions le
seront plus encore…
La discussion est
la clef du progrès…
Dr Abdesselam Zhiri
Beyrouth, 25 juin 2010